plasmideextractie

Plasmideextractie is een standaardlaboratoriumtechniek waarmee plasmide-DNA uit bacteriële cellen wordt geïsoleerd voor verder gebruik in moleculaire biologie. Plasmiden zijn kleine, circulaire en dubbelstrengige DNA-moleculen die onafhankelijk van het chromosoom kunnen repliceren en vaak gebruikmaken van markerings- of selectiegenen, zoals antibioticaresistentie. Het doel van plasmideextractie is plasmide-DNA te verkrijgen met voldoende zuiverheid en kwaliteit voor toepassingen zoals klonering, sequencing of transformatie.

De meest gangbare methode is alkaline lisis, gevolgd door zuivering. In eenvoudige termen worden de cellen geopend onder basische omstandigheden waardoor chromosomaal DNA en eiwitten grofweg scheiden van plasmide-DNA. Doordat plasmide-DNA over het algemeen kleiner is, blijft het plasmide-DNA in de supernatant of wordt het later gescheiden via precipitatie of via een silicakolom. Op kleine, middelgrote en grote schalen bestaan mini-, midi- en maxi-preparaties. Moderne kits maken gebruik van silicagel-kolom- of membraantechnologie voor snelle zuivering.

Kwaliteit en bruikbaarheid worden gecontroleerd met spectrofotometrie (A260/A280 rond 1,8-2,0; A260/A230 > 2,0) en bij voorkeur met een controle op integriteit via gelelektroforese. Yields hangen af van plasmide-copy-number, grootte en methode maar variëren doorgaans van enkele tot tientallen microgram per milliliter cultuur.

Toepassingen omvatten klonering en constructie van plasmidevectoren, functionele analyse van genen, sequencing en evaluatie van transformatie-efficiëntie.

Veiligheid: plasmideextractie wordt meestal uitgevoerd onder BSL-1-voorwaarden en vereist correcte afvalverwerking en zorgvuldigheid bij het omgaan met genetisch gemodificeerde organismen.

Zie ook: plasmide, moleculaire biologie, klonering.