biotinylatie

Biotinylatie is het covalent koppelen van biotine aan biomoleculen, meestal eiwitten of nucleïnezuren. Het doel is vaak om het gemodificeerde molecuul met hoge affiniteit te kunnen herkennen, zuiveren of detecteren met behulp van streptavidine- of avidinevolgorde koppelingen.

Chemische methoden richten zich op reactieve groepen op het doelmolecuul. Aminegerichte biotinylatie gebruikt NHS-biotine (of sulfo-NHS-biotine) dat reageert met primaire aminen, meestal Lys-residuen in eiwitten. Andere opties zijn biotine met mannelimide voor cysteïne-residuen of koolstofyliden-achtige reacties op specifieke substraten. Voor zulks soorten labeling geldt vaak dat het reactieve label in een spacer zit om sterische hindering te verminderen.

Enzymatische methoden bieden gecontroleerde, site-specifieke biotinylatie. BirA-enzym, gebruikt samen met een AviTag-peptide, voegt biotine aan een exact geplaatste lysine in het tag toe. Deze methode levert monolabeling met bekende stoichiometrie en wordt veel toegepast wanneer precisie vereist is, bijvoorbeeld voor in vivo labeling of tijdens purificatie en microarrays.

Toepassingen omvatten affinity-purificatie en pull-downs met streptavidine- of avidin-conjugaten, detectie met streptavidine-enzym- of fluoroprobeconjugaten, en beeldvorming of immobilisatie in biosensoren. Biotin-streptavidinebinding is extreem sterk, maar kan ook leiden tot nonspecifieke binding of functionele veranderingen in het gelabelde molecuul.

Overwegingen omvatten de mogelijke invloed op functie en structuur van het gelabelde molecuul, de mate en locatie van labeling, en de noodzaak van verwijdering van ongebonden biotine. Keuze tussen chemische en enzymatische methoden hangt af van gewenste specificiteit, labelgrootte en downstream-toepassingen.