proximiteitslabeling

Proximiteitslabeling is een proteomische methode die wordt toegepast om eiwitten in de buurt van een gekozen baiteiwit te labelen en daarmee de nabijheidsproteomen en interactieomgevingen in levende cellen in kaart te brengen. Door labeling van nabije eiwitten kunnen lokale eiwitnetwerken en subcellulaire microomgevingen worden onderzocht zonder dat directe fysieke interacties vereist zijn.

Het principe berust op een fusion van een labeling-enzym met het baiteiwit. Voorbeelden zijn BioID, APEX en TurboID. BioID gebruikt een mutante biotinylase die biotine aan nabije eiwitten koppelt in aanwezigheid van biotin, meestal over uren. APEX gebruikt een geëngineerde ascorbateperoxidase die biotin-phenol en H2O2 omzet in kortlevende radicals die nabijgelegen eiwitten labelen binnen minuten. TurboID is een versnelde variant die sneller labelt. De labels zijn covalent biotinylaties die later met streptavidine kunnen worden opgevangen en geïdentificeerd met massaspectrometrie.

De workflow omvat doorgaans het ontwerpen van een baiteiwit-enzym-fusie, expressie in de cellen, induceren van labeling, stoppen van labeling en cel lyseren, gevolgd door afvangst van gelabelde eiwitten met streptavidine-beads, enzymatische digestie en identificatie door LC-MS/MS. Data-analyse levert vervolgens een proximiteitsproteoom op en wijst op mogelijke interacties met het baiteiwit.

Toepassingen van proximiteitslabeling omvatten het in vivo in kaart brengen van lokale proteomen (bijvoorbeeld in organellen of membranen), het bestuderen van dynamische interacties tijdens signaaltransductie en het onderzoeken van moeilijke toestanden zoals membrancontacten. Het wordt toegepast in menselijke cellen, plantaardige systemen en medicijnen-gerelateerde modellen, onder voorbehoud van geschikte controles en interpretatie.

Voordelen en beperkingen: het vangt nabije eiwitten in hun natuurlijke context en kan transiente interacties onthullen, maar labelt nabijheid in plaats van directe binding. Achtergrondlabeling, de noodzaak van genetische tagging, en mogelijke cytotoxiciteit (bij APEX) vragen om zorgvuldige controls en interpretatie.