gelfiltratiechromatografie

Gelfiltratiechromatografie, ook wel size-exclusionchromatografie (SEC) genoemd, is een chromatografische methode waarbij moleculen worden gescheiden op basis van hun hydrodynamische grootte terwijl ze door geporeerde korrels van een stationaire fase bewegen. Deeltjes die te groot zijn om in de poriën te penetreren worden snel uitgescheiden en volgen een korter elutiepad, terwijl kleinere moleculen in de poriën kunnen penetreren en langzamer elueren. Deze methode behoudt doorgaans de native toestand van biomoleculen omdat er geen specifieke binding vereist is.

De stationaire fase bestaat uit geporeerde polymeren of glazen korrels met een verdeling van poriegroottes. Voorbeelden zijn dextran- en agarose-gebaseerde matrixen (zoals Sephadex en Sepharose) en polymeerbasis matrixen (zoals Superdex en Bio-Gel). De scheiding is afhankelijk van de grootte van de moleculen ten opzichte van de poriën. Belangrijke parameters zijn het void volume (Vo) en het totale kolomvolume (Vt). Elutievolumes (Ve) worden bepaald met standaarden van bekende molecuulgrootte, waarna een calibratiecurve log(Mw) tegen Ve wordt opgebouwd.

Toepassingen omvatten desalting en bufferuitwisseling, verwijdering van aggregaten, purificatie van eiwitten en koolhydraten, en schatting van molecuulgewichten. SEC werkt onder milde omstandigheden en is geschikt voor zowel analytische als preparatieve toepassingen, afhankelijk van kolomdiameter en flow. Detectie gebeurt meestal via UV-absorbantie of refractieve index.

Kernvoordelen zijn de niet-bindende, grootte-gerelateerde scheiding en het behoud van biologische activiteit; beperkingen zijn onder meer lagere resolveresolutie vergeleken met andere chromatografische technieken, en een afhankelijkheid van een geschikt groottebereik dat overeenkomt met de porieconfiguratie van de gebruikte matrix. Voor nauwkeurige MW-inschattingen en zuivering is correcte kolomkeuze en calibratie noodzakelijk.