GFPsysteem

GFPsysteem is een verzamelnaam voor technieken en gereedschappen die gebaseerd zijn op het groene fluorescente eiwit GFP om genexpressie en eiwitlokalisatie in levende cellen te visualiseren. GFP kan dienen als reporter of als fusie-eiwit met een doeleiwit. Het systeem maakt realtime observatie mogelijk zonder celbeschadiging.

Het GFP-gegeven komt van GFP uit de kwallen Aequorea victoria; in laboratoriums wordt GFP in cellen of organismen tot expressie gebracht onder controle van een promotor. Typische componenten zijn een GFP-construct, promotorregio, en optioneel fusie-sequenties om het doeleiwit op diverse plaatsen te lokaliseren. Soms worden ook selectie-markers of recombinatie-systemen gebruikt. De chromoforijontwikkeling vereist doorgaans zuurstof.

Werking: transcriptionele activiteit leidt tot productie van GFP, dat vouwt en matureren tot een fluorescerende chromofor. Bij specifieke excitatie wordt licht uitgezonden in het emissiespectrum; verschillende GFP-varianten hebben verschillende excitaties en emissies, wat multiplexing mogelijk maakt.

Toepassingen: het GFP-systeem wordt gebruikt om promoteractiviteit te meten, te observeren waar eiwitten terechtkomen en hoe ze zich bewegen in cellen, weefsels en levende dieren. Het biedt real-time imaging en kwantitatieve metingen via fluorescence-intensiteit. Ook wordt het ingezet bij high-throughput screening en flow cytometrie om cellulaire processen te evalueren.

Varianten en ontwikkelingen: aanpassingen zoals EGFP en sfGFP leveren grotere helderheid en snellere maturatie. Andere varianten verbeteren fotostabiliteit en werkingsomstandigheden in verschillende celtypen. Verder onderzoek richt zich op betere spectrale scheiding en minder interferentie met de celbiologie.

Overwegingen en beperkingen: maturatie-tijd, fotobleaching en autofluorescentie kunnen uitlezingen beïnvloeden. GFP-fusies kunnen de werking van het doeleiwit verstoren, en expressie-niveaus en positie van de fusie beïnvloeden interpretaties. Correcte controles en experimenteel ontwerp zijn essentieel.