Sequentiebepaling

Sequentiebepaling is het proces waarbij de volgorde van nucleotiden in een DNA- of RNA-molecuul wordt bepaald. Het doel is om genetische informatie vast te leggen, variaties op te sporen en bij RNA-sequencing de genexpressie te kwantificeren. Moderne sequencing omvat zowel traditionele Sanger-sequencing voor korte fragmenten als high-throughput sequencing (NGS) die miljoenen fragmenten gelijktijdig kan aflezen.

Methoden: Sanger-sequencing is een oudere methode die zeer accurate resultaten levert voor korte stukken DNA. Nieuwe benaderingen vallen onder next-generation sequencing (NGS), met platforms zoals Illumina (korte reads), PacBio SMRT en Oxford Nanopore (lange reads), en Ion Torrent. Deze technologieën verschillen in leeslengte, nauwkeurigheid en kosten.

Proces: de uitvoering begint met extractie van nucleïnezuren, gevolgd door bibliotheekvoorbereiding met fragmentatie, adapters en mogelijk barcodes. Vervolgens vindt het sequencing plaats en is er basecalling. Daarna volgt data-analyse: kwaliteitscontrole, trimming, alignering tegen een referentie of de novo-assemblage, variant calling en annotatie.

Output en toepassingen: de resulterende data omvatten reads, contigs, haplotypen en varianten zoals single nucleotide variants en indels, en bij RNA-Seq informatie over genexpressie. Toepassingen bevinden zich in klinische genetica en oncologie, infectieziekten, microbiologie, landbouw en evolutieonderzoek.

Overwegingen en geschiedenis: sequentiebepaling begon met Sanger-technieken in de jaren zeventig. In de jaren 2000 maakten NGS-technieken grootschalige genomica mogelijk, met als mijlpaal het Human Genome Project. Toekomstontwikkelingen richten zich op langere leestijden, real-time sequencing en directe RNA-sequencing, met aandacht voor kosten, bias en privacy.