InvitroTranskription

InvitroTranskription, auch in vitro Transkription (IVT) genannt, ist eine molekularbiologische Methode zur Synthese von RNA aus einer DNA-Vorlage in einem zellfreien System. Typischerweise kommt eine RNA-Polymerase zum Einsatz, die von Promotorsequenzen wie T7, T3 oder SP6 initiiert wird. IVT ermöglicht die gezielte Herstellung spezifischer RNA-Transkripte außerhalb lebender Zellen und wird in Forschung, Diagnostik und Biotechnologie breit eingesetzt.

Grundlage ist eine DNA-Vorlage, die einen Promotor vor der gewünschten RNA-Sequenz enthält. In einer Reaktionsmischung mit Nukleotiden, Magnesiumionen, RNase-Inhibitoren und einer geeigneten Pufferlösung transkribiert die Polymerase die RNA in 5′-zu-3′-Richtung. Häufig wird die DNA-Vorlage linearisiert, um ein sauberes Endtranskript zu gewährleisten. Zur Erzeugung translational aktiver mRNA können eine Capping- und eine Poly(A)-Schwänze nach der Transkription ergänzt werden. Für Nachweis- oder Faltungsstudien können markierte Nukleotide eingesetzt werden. Nach der Transkription erfolgt üblicherweise eine Reinigung des Transkripts.

Anwendungen umfassen die Herstellung von mRNA für In-vitro-Translation, RNA-Probes für Hybridisierungstests, die Produktion von sgRNA für CRISPR-Experimente sowie das Bereitstellen von RNA-Material in Forschungs- und Diagnostik-Settings. In einigen Fällen werden modifizierte Nukleotide eingesetzt, um Stabilität, Immunreaktionen oder Übersetzungsleistung zu beeinflussen. Die Wahl des Promotors, die Linearität der Vorlage und Endmodifikationen beeinflussen Effizienz und Nutzbarkeit der Transkripte.

Zu den Limitationen gehören Kontaminationsrisiken durch RNasen, potenzielle Ungenauigkeiten bei langen Transkripten und der zusätzliche Aufwand für Endmodifikationen, wenn eukaryotische Eigenschaften wie Cap und Poly(A) benötigt werden. IVT ist ein etablierter Standard in der Molekularbiologie und wird durch kommerzielle Kits und optimierte Protokolle unterstützt.