fluorometria

A fluorometria é uma técnica analítica que mede a fluorescência emitida por uma amostra após a sua excitação com luz de comprimento de onda específico. Quando certos materiais absorvem energia luminosa, eles elevam-se a estados excitados e, ao retornarem ao estado fundamental, podem emitir luz com comprimentos de onda diferentes. A intensidade da fluorescência é geralmente proporcional à concentração do fluoróforo, dentro de limites lineares.

Os principais componentes de um fluorômetro são a fonte de excitação (lâmpadas de xenônio, LEDs ou lasers), dispositivos de seleção de comprimento de onda para a excitação e para a emissão, o detector (geralmente fotomultiplicador) e o software de processamento. A leitura pode ser de emissão, em que se registra a intensidade de fluorescência a um determinado comprimento de emissão, ou de tempo de vida, que mede a desativação do estado excitado com atraso temporal.

A quantificação requer calibração com padrões conhecidos para construir curvas de resposta. Vários fatores podem influenciar o sinal, como quenching, efeito de filtro interno, solvente, pH, temperatura e autofluorescência da matriz. Técnicas de fluorometria podem envolver sondas fluorescentes específicas para biomoléculas, reagentes enzimáticos ou DNA/ RNA, além de aplicações em citometria de fluxo, ensaios imunoquímicos e monitoramento ambiental de poluentes fluorescentes.

Entre as vantagens estão alta sensibilidade, seletividade com sondas adequadas e amplo intervalo dinâmico. Limitações incluem a necessidade de fluoróforos ou fluoróforos intrínsecos, suscetibilidade a autofluorescência, fotodegradação e efeitos de absorção na amostra.