InnerFilterEffekt

Der Innerfiltereffekt (Innerfiltereffekt) beschreibt die Abschwächung von Anregungslicht und emittiertem Fluoreszenzlicht durch absorbierende Bestandteile der Lösung selbst. Dadurch sinkt die gemessene Fluoreszenzintensität, und insbesondere bei höheren Konzentrationen können feine spektrale Strukturen verzerrt erscheinen.

Es gibt zwei Hauptursachen: Der primäre Innerfiltereffekt tritt auf, wenn das Anregungslicht bereits an der Stelle des Fluorophors durch Absorption abgeschwächt wird, sodass weniger Fluorophor angeregt wird. Der sekundäre Innerfiltereffekt entsteht, wenn die emittierte Fluoreszenz während der Ausbreitung zur Detektion erneut absorbiert wird. In der Praxis können beide Effekte gleichzeitig auftreten, wobei A_ex die Absorbanz bei der Anregungswavelengthe und A_em bei der Emission beschreibt.

Auswirkungen sind eine nichtlineare Abhängigkeit der Fluoreszenz von der Konzentration, eine Reduktion der gemessenen Intensität und mögliche Veränderungen in der spektralen Form. Der Effekt ist insbesondere bei farbigen oder stark absorbierenden Proben relevant und kann zu falschen Quantifizierungen führen.

Korrektur und Maßnahmen: Eine gängige Korrektur verwendet F_corr = F_obs × 10^{(A_ex + A_em)/2}, wobei F_obs die gemessene Fluoreszenz ist. Diese Korrektur setzt homogene Proben, geeignete Geometrien und moderate Absorbanzwerte voraus. Zur Vermeidung des Effekts können Dilution, Front- Face-Messtechnik, geeignete Messgeometrien oder die Messung bei Wellenlängen erfolgen, bei denen die Probe weniger absorbiert.