Fluorescencespectroscopie

Fluorescencespectroscopie is een analytische techniek binnen de luminescentiespectroscopie die de fluorescentie van stoffen onderzoekt nadat deze zijn blootgesteld aan elektromagnetische straling. Bij de meeste moleculen vindt bij absorptie een elektronische overgang naar een hoger genieten toestand (meestal de S1-toestand) plaats, waarna de moleculen terugkeren naar de grondtoestand door het uitzenden van fotonen. Dit emissieproces gebeurt meestal met langere golflengten dan de excitatie, wat resulteert in een zogenaamde Stokes-verschuiving.

De opstelling van een fluorometer omvat doorgaans een excitatiebron (bijv. een lamp, laser of LED), een excitatiemonochromator om de benodigde golflengte te selecteren, een monsterhouder, een emissie-monochromator en een detector zoals een fotomultipliërbuis of een kelvin-gevoelige detector. Typische metingen zijn de emissiespectrum (intensiteit versus emissiewavelength bij vaste excitatie), en het excitatiespectrum (intensiteit versus excitatiewavelength bij vaste emissie). Tijdafhankelijke metingen leveren de fluorescence lifetime op, waarmee dynamische eigenschappen van fluoroforen kunnen worden onderzocht.

Toepassingen zijn onder meer kwantificering van biologische moleculen (zoals eiwitten en nucleïnezuren), detectie van fluoroforen in chemische analyses, materiaalonderzoek en milieumonitoring. Fluorescencespectroscopie biedt hoge gevoeligheid en vereist vaak weinig materiaaleenheden, maar kan gevoelig zijn voor fotobleaching, inner filter effecten en spectrale overlap tussen fluoroforen. Analyse omvat vaak quantum yield en lifetime bepaling, waarmee de efficiëntie en dynamiek van fluorescentie worden gekarakteriseerd.