IlluminaSequenzierung

Die IlluminaSequenzierung ist eine weit verbreitete Sequenziertechnologie, die von Illumina entwickelt wurde und in Forschungseinrichtungen sowie in der klinischen Genomik eingesetzt wird. Sie basiert auf dem Sequencing-by-Synthesis-Ansatz, bei dem DNA-Schablonen in repetitiven Zyklen vervollständigt und dabei jeweils fluoreszenzmarkierte Nukleotide belichtet und gemessen werden. Die Methode zeichnet sich durch hohe Genauigkeit, hohe Durchsatzraten und breite Anwendungsvielfalt aus.

Der technische Kern besteht aus der Flow-Cell-Technologie und der Clustering-Generierung. DNA-Fragmente werden an Adaptersequenzen gebunden und in vielen Kopien pro Fragment mittels Bridge Amplification vermehrt, wodurch Clusters entstehen, die einzeln identifizierbar sind. Während der Sequenzierungszyklen werden abwechselnd die vier Nukleotide hinzugefügt, wobei jedes Nukleotid mit einem reversiblen Terminator markiert ist. Nach der Bildaufnahme wird der Terminator wieder entfernte, sodass der nächste Zyklus erfolgen kann. Diese Vorgehensweise ermöglicht die Erfassung basenweise der Sequenz in parallelen Reads.

Typische Read-Formate sind Einzel- oder Paarendreads (zwei Leseabschnitte in entgegengesetzte Richtungen) mit gängigen Längen von bis zu 2x300 Basispaare (MiSeq) bzw. längeren Reads wie 2x150 bp auf anderen Plattformen. Die erzeugten Daten werden in Form von FASTQ-Dateien bereitgestellt und können nach Qualitätskontrolle, Alignierung und Downstream-Analysen weiterverarbeitet werden. Anwendungen umfassen Ganzgenom- und Exom-Sequenzierung, Zielgebietsstudien, RNA-Seq, Metagenomik und klinische Genomik.

Zu den Vorteilen gehören hohe Genauigkeit, konsistente Reproduzierbarkeit und umfassende Unterstützungsinfrastruktur. Zu den Limitationen zählen der relative Kurzcomparator gegenüber Langlesetechnologien, potenzielle GC-Bias-Effekte, Kosten pro Base sowie der Aufwand für Bibliotheksvorbereitung und Datenanalyse.