Fluoreszenzrekonstitution

Die Fluoreszenzrekonstitution ist eine molekularbiologische Methode, bei der ein fluoreszierendes Protein aus zwei oder mehr Fragmenten rekonstruiert wird. Typisch werden N- und C-Terminus eines Fluoreszenzproteins wie GFP getrennt und an zwei Proteine von Interesse fusioniert. Treten Interaktionen oder enge räumliche Nachbarschaften der Proteine auf, nähern sich die Fragmente, bilden den Chromophor und es erscheint Fluoreszenz.

Mechanisch dient die Rekonstitution als Indikator für Protein-Protein-Interaktionen oder räumliche Nähe zwischen Proteinen. Die Rekonstruktion kann irreversibel oder reversibel gestaltet sein, abhängig von der Wahl der Fragmente und der Konstruktion, was zu BiFC-ähnlichen Ansätzen führt. Die Intensität der Fluoreszenz spiegelt oft das Ausmaß der Wechselwirkung wider, liefert jedoch in der Regel kein zuverlässiges Timing der Dynamik.

Anwendungsgebiete umfassen die Visualisierung von Protein-Protein-Interaktionen in Zellen, die Lokalisierung von Proteinen sowie das Monitoring von Signalwegen in lebenden Zellen oder Organismen. Die Methode wird auch in Validierungsstudien und in einigen Hochdurchsatz-Assays eingesetzt, um direkte Interaktionsnachweise zu liefern.

Wichtige Designparameter sind der Split-Punkt innerhalb des Fluoreszenzproteins, die Länge und Beschaffenheit der Verbindungsstücke (Linker), sowie die Wahl des Fluoreszenzproteins (etwa GFP-, YFP-, CFP- oder mCherry-basierte Fragmente) und die Orientierung der Fragmente. Kontrollen mit Nicht-Interaktoren und Mutationen sind essenziell, um Hintergrundsignale zu beurteilen.

Zu den Einschränkungen gehören potenziell irreversibles Zusammenfügen, Stabilisierung künstlicher Interaktionen, Hintergrundsignale durch spontane Rekonstitution und begrenzte Quantifizierbarkeit; die Methode eignet sich eher für stabile Interaktionen als für schnelle Dynamik. Im Vergleich zu FRET liefert Fluoreszenzrekonstitution oft ein stärkeres, bleibendes Signal, aber weniger Informationen über Kinetik, weshalb sie häufig mit anderen Methoden kombiniert wird.