bisulfittsekvensering

Bisulfittsekvensering er en molekylærbiologisk metode for kartlegging av DNA-metylering på base-nivå. Metoden utnytter at umetylerte cytosin konverteres til uracil ved behandling med bisulfitt, mens metylerte cytosin (5-metylcytosin, 5mC) forblir uforandret under betingelsene. Etter PCR og sekvensering blir uracil til thymin, slik at cytosin som opprinnelig var umetylt blir til thymine i sekvensdataet. Ved å sammenligne med et referencegenom kan man bestemme metylasjonsstatusen til hver cytosinposisjon.

Prinsippet innebærer at den kemiske konverteringen gjør at metylering kan leses som baseendringer i sekvensdataet. Dataene gir mulig forbindelser mellom metylering og genuttrykk, og metoden gir ofte basepar-nøyaktig informasjon om CpG-deler i DNA.

Prosessen består av DNA-ekstraksjon, bisulfitt-konvertering, desulfonering og rensing, deretter PCR- eller bibliotekforberedelse og sekvensering (Sanger eller neste-generasjons-sekvensering). Dataanalyse krever kartlegging av sekvenser mot et konvertert referansegenom og beregning av metylasjonsandeler per CpG.

Varianter inkluderer whole-genome bisulfite sequencing (WGBS), reduced representation bisulfite sequencing (RRBS) og targeted bisulfite sequencing. Det finnes også metoder som oxidative bisulfite sequencing for å skille 5‑methylcytosin fra 5‑hydroxymethylcytosin.

Fordeler inkluderer høy oppløsning og mulighet til å kartlegge metylering på enkeltbasis. Begrensninger inkluderer DNA-degradering under beskyttende behandling, behov for høy sekwensjonsdybde og komplisert dataanalyse på grunn av konvertering og komplementære strenger. Bisulfittsekvensering er et viktig verktøy i epigenetikk og cancerforskning.