Stegförsteglagning

Stegförsteglagning, även känd som stepwise ligation, är en metod inom molekylärbiologi för att sammanfoga DNA-fragment genom att koppla ihop dem i en serie separata ligationssteg snarare än i en enda reaktion. Metoden används främst när konstruktioner av ökad längd eller komplexitet behövs, och där man vill ha ökad kontroll över varje sammansättningssteg.

Processen innefattar vanligtvis design av fragment med kompatibla ändar eller överhäng. Efter varje ligation verifieras resultatet innan nästa steg påbörjas. Oftast används selektionsmarkörer eller PCR-analys för att identifiera rätt kloner efter varje steg. I praktiken genomförs ligationen med restriktionsenzymer och DNA-ligas, och ibland används adapters eller länkar för att bevara läsramen mellan fragmenten.

Jämfört med en‑pot-reaktioner såsom Gibson- eller Golden Gate‑assembly erbjuder steg-för-steg-ligation ökad kontroll och möjlighet att minimera fel i varje steg, men den kräver längre tid och fler hanteringssteg. Metoden kan vara särskilt användbar när antalet fragment är stort eller när exakt sekvenskontroll är viktig.

Användningsområden inkluderar modulär plasmidkonstruktion, väg-baserad syntetisk biologi och gen-syntes där noggrann verifiering av varje led är önskvärd. Begränsningar inkluderar tidsåtgång, ökad risk för mutationer vid upprepad hantering och minskad effektivitet när antalet fragment växer.

Se även: DNA-ligas, kloning, Gibson-assembly, Golden Gate-assembly, sekventiell montering.