RNAseqllä

RNAseqllä tarkoitetaan korkeatuottoista seuraavan sukupolven sekvensointia, jolla kartoitetaan koko transkriptominen RNA. Näyte eristetään solusta tai kudoksesta, RNA:ta laaditaan ja muunnetaan cDNA:ksi, ja kirjastoihin lisätään sekvensointia varten adapterit. Kirjastot sekvennoidaan yleisimmin lyhyillä luetteloilla (reads), useimmiten Illumina-alustoilla, mikä tuottaa suuria määriä RNA-sekvenssitietoa. RNAseqin avulla voidaan sekä mitata geenien ilmentymää määrällisesti että löytää uusia transkriptioita sekä vaihtoehtoisia splicing-muotoja.

Työprosessi etenee vaiheittain: näytevalinta ja RNA-eristys sekä laatutarkastus; rRNA:n poisto tai poly(A)-valinta; kirjasto valmistus ja sekvensointi. Data-analyysissä suoritetaan laadunvarmistus ja trimmaus, luenta viitegenomiin tai -transkriptomeen sekä transkriptikohtainen kvantitatiivinen arviointi ja normalisointi (esim TPM tai CPM). Tämän jälkeen voidaan tehdä differentiaalisen ilmentymän analyysi sekä löytää uusia splicing- tai transkriptiformoja sekä kartoittaa muutoksia kokonaistranskriptomissa. Yksittäisten solujen tasolla tehtävä single-cell RNA-seq paljastaa solujen välisen heterogeenisyyden ja tilamuutoksia.

Käyttökohteet kattavat geenien ilmentymän profiiloinnin, kehitys- ja tauti-ilmiöiden tutkimisen sekä uusien biomarkkereiden löytämisen. RNAseq on joustava ja kattava menetelmä, jonka avulla voidaan kartoittaa solutyyppien ilmentymäsuhteita ja löytää uusia transkriptioita. Yksittäisien solujen tasolla tehtävä single-cell RNA-seq paljastaa solujen välisen heterogeenisyyden ja tilamuutokset.

Rajoitteita ovat kustannukset, tarve laskennallisille resursseille ja bioinformatiikan osaamiselle; tekniset vinoumat kuten library prep bias, GC-content ja PCR-bias; sekä haasteet pitkien isoformien erottamisessa lyhyillä luvuilla. Tulosten tulkinta vaatii asianmukaista normalisointia ja tilastollisia menetelmiä.