Primerpaare

Primerpaare sind zwei Oligonukleotide, die in der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet werden, um eine spezifische DNA-Region zu vervielfältigen. Sie bestehen aus einem Vorwärtsprimer, der an den Vorwärtsstrang bindet, und einem Umkehrprimer, der komplementär zum Gegenstrang liegt. Die Primer flankieren die Zielsequenz, so dass die DNA-Polymerase den Abschnitt zwischen den Primern repliziert.

Design und Eigenschaften: Idealerweise haben Primer eine Länge von 18–25 Nukleotiden, eine GC-Verteilung von etwa 40–60 %, und eine ähnliche Schmelztemperatur (Tm) für beide Primer (ungefähr 55–65 °C). Wichtige Kriterien sind eine stabile 3′-Ende, möglichst kein starkes Primer-Dimer oder Hairpin-Strukturen, und geringe Selbst- oder Fremdvervielfältigung zwischen den Primerpaaren. Die so erzeugte Ampliconlänge variiert je nach Anwendung; typische Bereiche: 70–150 Basenpaare in der Quantitativen PCR (qPCR), 100–1000 Basenpaare in Standard-PCR. Für Klonierungs- oder Sequenzierungsanwendungen können Überhänge, Restriktionsschnittstellen oder Adaptersequenzen vorgesehen sein. Degenerierte Primer finden Einsatz, wenn Variation in der Zielregion bekannt ist.

Anwendungen: Primerpaare sind unverzichtbar für konventionelle PCR, RT-PCR, qPCR, Sequenzierungsvorbereitung und Klonierung. In Multiplex-PCR können mehrere Primerpaare in einer Reaktion kombiniert werden, während Nested PCR zwei Primerpaare in aufeinanderfolgenden Schritten verwendet, um die Spezifität zu erhöhen.

Validierung und Herausforderungen: Vor der Praxis werden Primerpaare in der Regel in Computersimulationen gegen Referenzgenome geprüft, um Off-Target-Amplifikation zu vermeiden. Danach erfolgen empirische Optimierung von Primerkonzentration, Annealing-Temperatur und Zyklusbedingungen sowie Kontrollen auf Nicht-Templates.