Primerpaaren

Primerpaaren (auch als Primerpaare bezeichnet) sind zwei kurze DNA-Oligonukleotide, die bei der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) jeweils an gegenüberliegenden Strängen der Zielsequenz binden und die Enden des zu amplifizierenden Abschnitts kennzeichnen. Sie bestimmen die Orientierung der Amplifikation und die Länge des Amplicons.

Bei der Gestaltung von Primerpaaren sind mehrere Kriterien wichtig: Typischerweise sind sie 18–25 Nukleotide lang, der Schmelzpunkt (Tm) sollte für beide Primer ähnlich sein, der GC-Gehalt liegt meist bei etwa 40–60 %. Es gilt, Sekundärstrukturen wie Haarnadeln oder Primer-Dimeren zu vermeiden, insbesondere am 3'-Ende. Die Primer sollten spezifisch auf die Zielsequenz ausgerichtet sein und keine bedeutende Homologie zu anderen Genomregionen haben; dazu werden in silico-Überprüfungen, beispielsweise BLAST, genutzt. Die erwartete Produktgröße hängt von der Anwendung ab und liegt bei Standard-PCR meist im Bereich von 100–1000 Basenpaaren.

Primerpaaren werden in verschiedenen PCR-Anwendungen eingesetzt, einschließlich Standard-PCR, Quantitative PCR (qPCR bzw. RT-qPCR), Sequenzierungsvorbereitung, Klonung und Diagnostik. In Multiplex-PCR müssen die Primerpaare kompatibel sein, ähnliche Tms besitzen und Amplicons unterschiedliche Größen liefern, um eine gleichzeitige Amplifikation mehrerer Zielabschnitte zu ermöglichen.

Für die Bestellung werden Primer oft als desalted oder PAGE-purified geliefert, je nach Anforderung. Fehlerhafte Primer können zu unspezifischer Amplifikation, Primer-Dimeren oder Ausfällen führen. Regelmäßige Kontrollen der Primerqualität und erneute Validierung mit Kontrollen sind üblich.