PCRförberedelser

PCRförberedelser avser de förberedande momenten innan polymeraskedjereaktionen PCR genomförs. Målet är att möjliggöra en tillförlitlig förstärkning av en målmolekyl och att resultaten kan tolkas korrekt. Vanliga PCR-varianter inkluderar konventionell PCR, realtids-qPCR och RT-qPCR.

Planering och provhantering

Val av metod utgår från målsekvensen och provets natur. Det är viktigt att definiera målregionen, eventuell omvandling av RNA till cDNA vid RT-qPCR samt vilka kontrollåtgärder som behövs. Arbetsflödet bör utformas för att minimera kontaminering och felaktiga resultat.

Nukleinsyreparation och kvalitetsbedömning

Standardförberedelser omfattar isolering av DNA eller RNA från provet samt bedömning av koncentration och renhet. Kvalitetsmått kan innefatta spektrala mått eller fluorometrisk mätning samt kontroll av nedbrytning och kontaminanter. Endast lämpligt kvalitetsmaterial används i vidare steg.

Primerdesign och val av assay

Primers och eventuella prober designas för specifik bindning till målsekvensen och lämplig omfattning. Vidare beaktas specifitet, avstånd mellan primerpar och undvikande av sekundära strukturer. För RT-qPCR krävs även omvandling av RNA till cDNA.

Reagens, uppsättning och arbetsflöde

Används vid behov standardiserade reagens och master mixes för PCR, inklusive polymeras, dNTPs och buffersystem. En korrekt förberedd arbetsflöde och dokumentation minskar variation och felkällor.

Kontaminations- och kvalitetskontroll

Åtskilda arbetsområden och användning av skyddsutrustning, filtertips och negativa kontroller är centrala för att undvika föroreningar och falska positiva resultat. Positiva kontroller och repliker förstärker tolkningen.

Dokumentation och bedömning

Alla steg dokumenteras noggrant, och resultat tolkas i relation till kontroller och specifikationer. Vid qPCR ingår analys av cykler och eventuella melting curves; vid RT-qPCR bedöms cDNA-kvalitet.

Säkerhet och efterlevnad

PCRförberedelser följs i enlighet med biosäkerhets-, miljö- och laboratoriestandarder, inklusive korrekt avfallshantering och utrustningsunderhåll.