TwoPhotonMikroskopie

TwoPhotonMikroskopie bezeichnet eine Fluoreszenzmikroskopie-Technik, bei der Fluorophore durch die gleichzeitige Absorption zweier Photonen mit niedrigerer Energie (typisch im nahen Infrarot) angeregt werden. Die Anregung hängt quadratisch von der Lichtintensität ab, wodurch die Emission fast ausschließlich im Fokus entsteht und Out-of-Focus-Belichtung vermieden wird.

Die Technik nutzt kurze Pulslaser (in der Regel Femtosekunden-Ti:Saphir-Laser, wahlweise Faserlaser) mit hoher Leistung und geringem Duty Cycle. Die Bildgebung erfolgt meist durch Rasterung mit galvanometrischen oder resonanten Scannern. Die Detektion geschieht über Photomultiplier (PMTs) in einem epi-fluoreszenz- oder konfokalen Aufbau. Typische Systeme verwenden Objektive mit hoher Numerischer Apertur, um die Feldstärke im Fokus zu maximieren.

Zu den Vorteilen zählen eine größere Eindringtiefe dank nahinfraroter Wellenlänge, reduzierte Phototoxizität außerhalb des Fokus, intrinsische optische Schnittebene und gut geeignetes 3D-Imaging in skalierten Geweben. Nachteile umfassen die hohen Kosten und Komplexität der Laserquellen, teilweise geringe Two-Photon-Absorptionsquerschnitte für manche Fluorophore, begrenzte Bildgeschwindigkeit bei großen Pixelfeldern und Beeinflussung der Auflösung durch Gewebe-Streuung.

Anwendungen finden sich vor allem in der Biologie und Neurobiologie, etwa zur In-vivo-Bildgebung von Gehirnneuronen, Entwicklungsbiologie, Gewebestudien und Funktionsmessungen mit Calcium- oder Voltage-Indikatoren. Zusätzlich wird sie oft mit Second-Harmonic Generation zur nicht-fluoreszenzbasierten Bildgebung kombiniert. Die Technik stammt aus den frühen 1990er-Jahren und hat sich zu einer Standardmethode für Tiefenbildgebung entwickelt.