Spektrofotometrian

Spektrofotometrian är en analytisk disciplin som mäter hur mycket ljus ett prov absorberar eller överför över olika våglängder och används för att kvantifiera ämnen i lösningar. Den vanligaste varianten är UV–Vis-spektrofotometri, men metoder för infraröd och andra regioner används också. Tekniken bygger på att ljuset genom provet blixts bortfall tillsammans med hur mycket som når detektorn noggrant mäts.

Principen bygger på två grundbegrepp: absorbans och transmittans. Ljuset som sänds mot provet jämförs med ljuset som passerar igenom utan prov (blank). Absorbans A och transmittans T relateras genom A = -log10(T) och T = I/I0, där I respektive I0 är intensiteterna av överförd respektive ursprunglig strålning. För lösningar följer ofta Beer-Lambert-lagen A = ε l c, där ε är den molekylära absorptionskoefficienten, l är väglängden i centimeter och c är koncentrationen. Denna relation möjliggör kvantitativ bestämning av ämnen i lösning.

Instrumentering består vanligtvis av en ljuskälla, en monokromator som väljer våglängd, en provkammare (cuvetter), en detektor och en signalbehandlande enhet. En dubbelbelysning används ofta för att reducera systematiska fel. Våglängdsområdet för UV–Vis-spektrofotometri ligger vanligtvis på cirka 200–800 nanometer.

Genomförande innebär att prover förbereds och blanks tas som referens. Absorbans uppmäts vid önskad våglängd eller som funktion av våglängd för spektrogram. Kalibreringskurvor används för att bestämma koncentrationer i okända prover baserat på deras absorbansvärden.

Användningsområden inkluderar kvantifiering av proteiner och nukleinsyror, analys av färgämnen och läkemedel, miljöövervakning samt generell kemisk och biokemisk analys. Behandlingen av data kräver korrekt kalibrering, lämpliga cuvetter och kontroll av faktorer som kan påverka mätningen, såsom lösningens färg, turbidity och muskalig scattering.