RNApreparatie

RNApreparatie verwijst naar het isoleren en zuiveren van RNA uit biologische monsters zodat het geschikt is voor moleculaire analyses. Het doel is RNA van hoge integriteit en zuiverheid te verkrijgen met zo min mogelijk DNA-contaminatie en andere verontreinigingen.

Veelgebruikte methoden zijn chemische fenol/chloroform-extractie met guanidine-thiocyanaat (bijv. TRIzol) en silica-gebaseerde spinkolommen. Over het algemeen omvat RNApreparatie cel- of weefsellyse, inactivatie van RNases, binding van RNA aan een matrix, wassen en elutie. Indien nodig kan DNA-contaminatie met DNase worden verwijderd om verstoringen in downstream analyses te voorkomen.

Kwaliteitscontrole is essentieel: RNA-integriteit wordt vaak beoordeeld met een RIN-waarde (bijv. via een Bioanalyzer) en zuiverheid met spectrofotometrie (A260/280 en A260/230). Een A260/280 rond circa 2,0 en een A260/230 tussen 2,0 en 2,2 worden doorgaans als aanwijzing voor zuiver RNA beschouwd. Voor veel transcriptieanalyses is een RIN hoger dan 7–8 gewenst, terwijl experimenten met lagere RIN mogelijk meer uitdaging geven.

Belangrijke aandachtspunten zijn onder meer het voorkomen van RNase-activiteit en RNA-degradatie. Dit vereist een RNase-vrije omgeving, behulp van RNase-vrije reagentia, handschoenen en snelle verwerking, evenals opslag bij -80°C en minimale freeze-thaw-cycli.

Toepassingen van RNApreparatie omvatten onder meer qPCR, reverse transcription qPCR (RT-qPCR), RNA-Seq, Northern blot en microarray-analyses. Een betrouwbare RNAvoorraad is cruciaal voor reproduceerbare en accurate resultaten in moleculaire biologie.