Fluoreszenzmessungen

Fluoreszenzmessungen umfassen die Messung der Lichtemission von Substanzen, die durch Lichtanregung angeregt werden. Sie dienen der Quantifizierung, Detektion und Bildgebung in Biologie, Chemie und Umweltwissenschaften.

Grundlagen: Wenn Moleküle Licht einer bestimmten Anregungswellenlänge absorbieren, gelangen Elektronen in angeregte Zustände. Nach schneller Rückkehr in den Grundzustand emittieren sie Photonen. Die Emission hat oft eine längere Wellenlänge als die Anregung (Stokes-Shift). Die Fluoreszenzquantenausbeute (Quantum yield) beschreibt den Anteil der absorbierten Photonen, der emittiert wird. Die Fluoreszenzlebensdauer gibt an, wie lange die Emission nach der Anregung anhält (typisch Nanosekunden). Zeitaufgelöste Messungen verwenden Methoden wie TCSPC.

Messinstrumente und Messmodi: Typische Geräte sind Spektrofluorometer, die Emissions- und Absorptionsspektren erfassen, sowie Fluorometer in Mikroplatten- oder Mikroskopversionen. Ergänzend kommen Fluoreszenz-Mikroskope (einschließlich Konfokal- und Mehrphotonen-Mikroskopie) sowie Durchflusszytometer mit fluoreszenzdetektoren zum Einsatz. Messmodi umfassen steady-state (normale Intensität oder Emissionsprofil) und zeitaufgelöste Messungen (Lebensdauer).

Probenvorbereitung und Kalibrierung: Proben sollten geeignete Pufferbedingungen, geringe Autofluoreszenz und ausreichende Anregbarkeit aufweisen. Quantitative Arbeiten erfordern Referenzstandards und Kalibrierung; Quininsulfat in Schwefelsäure wird als Standard für die Bestimmung der Fluoreszenzquantenausbeute genutzt. Hohe Konzentrationen können Quenching und Innere-Filtereffekte verursachen, die Messungen verzerren.

Anwendungen und Einschränkungen: Fluoreszenzmessungen finden Anwendung in Biochemie, Molekularbiologie, Zellbiologie, Diagnostik und Umweltmonitoring sowie in der Bildgebung von Zellen oder Geweben. Zu den Einschränkungen gehören Photobleaching, Autofluoreszenz und Quenching; außerdem beeinflussen Innere Filtereffekte und optische Dichte die Signale, insbesondere bei dicken Proben. Gute Kalibrierung und geeignete Fluorophore minimieren diese Probleme.