FRETbasiierte

FRETbasierte Verfahren nutzen den Förster-Resonanz-Energieübertragungseffekt (FRET), um die räumliche Nähe zweier Fluorophore zu charakterisieren. Üblich sind ein Donor- und ein Akzeptorfluorophor, die an Moleküle, Proteine oder Nukleinsäuren gekoppelt werden. Wird der Donor angeregt und der Abstand zum Akzeptor klein genug, erfolgt Energieübertragung an den Akzeptor statt Emission des Donors, woraufhin dieser emittiert.

Die Effizienz der Energieübertragung hängt stark von der Distanz r und der Orientierung der Dipole ab und folgt annähernd der Gleichung E = 1/(1+(r/R0)^6). Der Förster-Abstand R0, abhängig von Spektralüberlappung, Quantenwirkungsgrad des Donors und Dipolorientierung, liegt typischerweise zwischen 2 und 8 Nanometern.

FRET kann ratiometrisch gemessen werden, indem Emissionen des Donors und Akzeptors verglichen werden, oder lebensdauerbasiert (FLIM-FRET), bei dem die Lebensdauer des Donors in Gegenwart des Akzeptors verkürzt wird. FLIM-FRET reduziert Abhängigkeiten von Konzentration und Belichtungsbedingungen.

Anwendungsfelder umfassen Biosensoren, Messung von Protein-Protein-Interaktionen, Konformationsänderungen, Ligandenbindung und genomisch kodierte Sensoren, etwa Calcium-Sensoren, die auf Fluorophor-Paaren wie CFP–YFP basieren. In der Materialwissenschaft dienen FRET-Systeme der Distanzmessung in Nanostrukturen.

Bei der Anwendung sind Kontrollen nötig, darunter Donor-Only- und Akzeptor-Only-Proben, negative FRET-Kontrollen sowie Korrekturen für Bleed-Through und direkte Anregung des Akzeptors. Zu beachten sind die Einschränkungen: der beobachtete FRET-Effekt ist auf einen engen Distanzbereich beschränkt, die Orientierung der Fluorophore führt zu Unsicherheiten, und Photobleaching sowie Konzentrationsunterschiede können Messergebnisse beeinflussen.