EnkeltcelleRNAsekventering

EnkeltcelleRNAsekventering (scRNA-seq) är en metod för att mäta genuttryck i enskilda celler. Den gör det möjligt att studera celltyper, celltillstånd och biologisk heterogenitet i vävnader genom att analysera mRNA från varje cell. Genom att tilldela varje cell en unik barcode och, i många protokoll, en unik molekylidentifierare (UMI), möjliggör metoden noggrann kvantifiering av transcriptnivåer trots små mängder RNA.

Arbetsflödet innefattar först isolering av singelceller eller kärnor från vävnad (t.ex. via FACS eller mikroflyt), följt av omvandling av RNA till cDNA med cellbaserade barcodes och UMIs, samt amplification, bibliotekförberedelse och slutligen höggenströmd sekvensering (ofta på Illumina-plattformar).

Två vanliga tekniker är droplet-baserad scRNA-seq, där celler fångas i mikrodroppar tillsammans med barcodes och UMIs, och plattbaserad scRNA-seq (t.ex. SMART-seq och SMART-seq2), som ofta ger fullständiga längder av cDNA per cell och därmed högre upplösning, men normalt lägre throughput än droplet-metoder.

Dataanalys i scRNA-seq omfattar demultiplexing, sekvensläsning, avkodning av UMIs och kvantifiering av genuttryck per cell, följt av normalisering, dimensionell reduktion (t.ex. PCA, t-SNE eller UMAP) och klustring för att identifiera celltyper eller tillstånd. Differentialuttryck och utvecklingsspårning (pseudo-tid) används för att följa förändringar över tid. Tekniken är känslig för dropouts och batchvariation.

Användningar inkluderar kartläggning av nya celltyper, studier av utvecklingsvägar, tumörheterogenitet och immunologisk profilering. Begränsningar är kostnad, behov av avancerad bioinformatik och kraftig vävnadsdissociation; tekniska artefakter och dropouts påverkar kvantifiering av lågt uttryckta gener. Forskning fortsätter att förbättra protokoll och analysverktyg, inklusive snRNA-seq för svåra vävnader och kombinationer med andra avläsningstekniker.