PCRmenetelmää

PCRmenetelmää (polymeraasiketjuntamääritys) on laboratoriotekniikka, jolla pienestä DNA- tai RNA-palasta voidaan tuottaa suuria määriä samaa DNA-sekvenssiä. Menetelmä kehitettiin 1980-luvulla (Kary Mullis) ja siitä on tullut yksi tärkeimmistä työkaluista biologiassa, biokemiassa ja diagnostiikassa. PCR mahdollistaa kohdealueen monistamisen nopeasti ja tarkasti.

Periaate perustuu toistuvaan lämpötilavaihteluun, joka mahdollistaa DNA-ketjun avaamisen, liimaantumisen ensisijoittelijoihin ja uuden DNA-tarttumisen. Tyypilliset vaiheet ovat denaturointi (noin 95 °C), annealing- eli tarttuminen primers-alueelle (noin 50–65 °C) sekä extensio (noin 72 °C) katalysoituna DNA-polymeraasilla. Jokainen sykli kaksinkertaistaa kohde-DNA:ta, jolloin monistuskasvu on eksponentiaalinen.

Tyypit ja laajentuneet sovellukset: konventionaalinen PCR tuottaa näkyvän tuotteensa agarosigeelin tai muiden menetelmien avulla. RT-PCR (tai RT-qPCR) käyttää RNA-mallia, johon käänteiskopioijaentsyymi luo cDNA ennen PCR:ää. Reaaliaikaisessa PCR:ssä (qPCR) seuraa tuottautumista fluoresenssin avulla ja saadaan määrällistä tietoa. Muita variantteja ovat digitaalinen PCR, multiplex-PCR ja Nested-PCR (lisätty tarkkuus).

Käyttökohteita ovat geneettinen kloonaus, mutaatioiden todentaminen, sekvensointi- valmistelu, patogeenien diagnosointi kliinisessä näytteessä, rikostekninen analyysi sekä ympäristö- ja elintarvikevalvonta. Menetelmä vaatii huolellista suunnittelua, kontaminaation välttämistä sekä asianmukaisia kontrolli- ja tulkintakäytäntöjä. Rajoitteita ovat kontaminaatioriski, sekä riippuvuus hyvästä näytteenlaadusta ja hyvän primerisuunnittelun merkitys.