AnnexinVPIFärbungen

AnnexinVPI-Färbungen sind eine Doppel-Färbemethode zur Bestimmung von Apoptose- und Nekrosephänomenen in Zellen, üblicherweise eingesetzt in der Durchflusszytometrie. Sie ermöglichen eine schnelle Unterscheidung verschiedener Zellzustände anhand zweier Marker: Annexin V bindet an externes Phosphatidylserin, das bei Apoptose auf die Außenseite der Zellmembran verschoben wird, während Propidiumiodid (PI) in Zellen mit kompromittierter Membran DNA bindet.

Prinzip: Lebende Zellen zeigen kein externes PS und eine intakte Membran, daher Annexin V negativ und PI negativ. Frühe Apoptose: Annexin V positiv, PI negativ. Späte Apoptose oder Nekrose: Annexin V positiv, PI positiv. Nekrose ohne PS-Exposition ist selten, kann aber auch auftreten; in der Praxis wird häufig von einem Vier-Farben-Quadranten-Plot gesprochen, wobei weitere Kontrollen zur Unterscheidung genutzt werden.

Durchführung: Zellsuspension wird in einem Ca2+-reichen Annexin V Bindungs-Puffer mit einem fluoreszenzmarkierten Annexin V inkubiert, oft FITC-Annexin V, gefolgt von PI. Die Inkubation erfolgt typischerweise 15–20 Minuten im Dunkeln. Danach erfolgt die Messung durch Durchflusszytometrie, wobei Annexin V-Farbenkanäle und PI-Kanal analysiert werden. Wichtige Kontrollen umfassen unbehandelte Zellen, Einzelstain-Kontrollen und geeignete Kompensationsstandards.

Interpretation und Anwendungen: Die Technik dient in der Forschung der Quantifizierung von Apoptose- und Nekrosehäufigkeiten, z. B. in Studien zu Zytotoxizität, Wirkstoffscreening oder Immunzellaktivierung. Sie wird oft in Kombination mit weiteren Markern (etwa Caspase-Aktivierung) verwendet, um spezifischere Aussagen über den Zellzyklus und den Todesweg zu ermöglichen. Limitationen umfassen Artefakte durch Probenhandhabung, PS-Exposition in anderen Zellprozessen und die Tatsache, dass der Marker keine eindeutige Unterscheidung zwischen Apoptose und Nekrose allein erlaubt. Sicherheit: PI ist ein potenziell schädlicher Farbstoff; geeignete Schutzmaßnahmen und Entsorgung beachten.