peptidnivåidentifiering

Peptidnivåidentifiering är inom proteomik termen för processen att tilldela specifika peptidsekvenser till observationsdata från masspektrometri i tandem (LC-MS/MS) och att bedöma identitetens trovärdighet på peptidnivå. Målet är att kartlägga vilka peptider som finns i ett prov, vilket i sin tur stödjer slutsatser om vilka proteiner de härstammar från.

Arbetsflödet omfattar vanligtvis: provförberedelse och enzymatisk nedbrytning av proteiner till peptider, ofta med trypsin; mätningar med LC-MS/MS; databassökning där varje spektrum jämförs med teoretiska spektra i ett protein- eller peptiddatabas med algoritmer som Mascot, Sequest/X!Tandem eller TurboSEQUEST. Resultatet består av peptide-spectrum matches (PSM) som bedöms med score- eller sannolikhetsbaserade mått. För att uppskatta felaktiga upptäckter används decoy-databaser och kontroll av falsk upptäckthastighet (FDR), ofta på peptidnivå. Denna process möjliggör en sammanställning av en lista över identifierade peptider och, i många fall, vidare proteininferens.

Jämfört med endast att bedöma spektra individuellt ger peptidnivåvalidering ofta robustare kontroll av FDR och bättre stöd för kvantitativ analys. När peptider tilldelas proteiner krävs ofta inferensregler eftersom samma peptid kan förekomma i flera proteiner. Peptidnivåidentifiering används också i kvantitativ proteomik, där intensiteter för identifierade peptider används för att uppskatta proteinnivåer.

Utmaningar inkluderar posttranslationala modifieringar (PTMs), genetiska varianter och icke-specifika klyvningar som ökar antalet möjliga peptider; delade eller degenererade peptider som ger otydliga proteininferenser; låga signaler och brus i spektrometri samt behovet av noggranna decoy-strategier för FDR-estimering.

Användningsområden inkluderar grundforskning i proteomik, biomarkörsletning, klinisk diagnostik och kvalitetskontroll i biomedicinska tillämpningar. Peptidnivåidentifiering utgör grunden för proteininferens och kvantitativ proteomik samt möjliggör jämförelser mellan prover och experiment.