bisulfiittisekvensoinnilla

Bisulfiittisekvensointi (bisulfiittisekvensoinnilla) onDNA-metylaation kartoitukseen käytetty menetelmä, jolla voidaan määrittää, ovatko yksittäiset sytosiiniset bases metyloituneet vai eivät. Bisulfiittikäsittelyn aikana epämetyloidut cytosiinit muuttuvat urasileiksi, ja tämän seurauksena sekvensioinnissa niille kohdille luetaan T (tymiini). Metyloituneet cytosiinit pysyvät cytosiineina. Näin voidaan erottaa metyloituneet ja epämetyloidit cytosiinit samalla genomin tai sen osan tasolla.

Työnkulku etenee yleensä siten, että DNA eristetään näytteestä ja altistetaan natriumbisulfiitille, joka muuttaa epämetyloidit cytosiinit. Tämän jälkeen DNA-palat voivat pastöivityksen tai PCR-erkepäilyt. Seuraavaksi suoritetaan sekvensointi (esimerkiksi Sanger- tai next-generation sequencing), ja saatu sekvensio verrataan viitetekstiin. Muutos C→T osoittaa epämetyloidin sytosiinin, kun taas säilynyt C viittaa metyloituun sytosiiniin. Tuloksista muodostetaan metylaatiomatriisi, joka kuvaa metyylaation esiintymisen perimässä.

Variaatiot ja sovellukset kattavat: whole-genome bisulfite sequencing (WGBS), reduced representation bisulfite sequencing (RRBS) sekä kohdennettu bisulfite-sekvensointi, kuten PCR-amplicon-sekvensointi. Käytetään muun muassa ihmisen ja kasvien perimän metylaation kartoituksessa, solujen kehityksen ja syövän epigenetiikan tutkimuksessa sekä referenssitietokantojen rakentamisessa.

Rajoitukset liittyvät käsittelyn DNA-hajoamiseen, konversiokonversion epävarmuuksiin sekä mahdolliseen epätasaiseen konversioon. Tarvitaan hallitut kontrollit ja asianmukainen analyysimenetelmä, jotta metyylaatiot voidaan luotettavasti tulkita.