Transkriptquantifizierung

Transkriptquantifizierung bezeichnet den Prozess der Bestimmung der Abundanz von Transkripten in biologischen Proben. Ziel ist es, die Expressionslevel von Transkripten wie mRNA oder nicht-kodierenden RNAs in verschiedenen Bedingungen zu vergleichen und so Mechanismen der Genregulation, Biomarker oder therapeutische Targets zu verstehen.

Methodisch unterscheidet man zwischen relativer und absoluter Quantifizierung. Zu den klassischen Methoden gehört die quantitative PCR (qPCR) bzw. digitale PCR (ddPCR), die relative Abundanzen anhand von Ct-Werten liefern. Durch Referenzgene oder Standardkurven lassen sich auch absolute Kopienzahlen bestimmen. Bei der Hochdurchsatzquantifizierung wird häufig RNA-Sequencing (RNA-Seq) eingesetzt. Aus gelesenen Reads werden Transkriptabundanzen geschätzt; übliche Metriken sind RPKM/FPKM (jeweils angepasst an Transkriptlänge und Gesamtlesemenge) sowie TPM, das über Proben hinweg vergleichbar bleiben soll. Tools wie Kallisto, Salmon oder RSEM schätzen Abundanzen effizient aus Rohdaten.

Normalisierung ist ein zentrales Thema, um technische Unterschiede in Sequenzierdepth, Transkriptlänge und mappability zu korrigieren. Typische Ansätze umfassen Library-Size-Normalisierung, TMM- oder upper-quartile-Normalisierung; in qPCR-Projekten dienen Referenzgene der Stabilität der Messung. Transkriptquantifizierung kann auf Transkript- oder Genebene erfolgen; häufig folgen Differentialexpressionsanalysen mit Tools wie DESeq2 oder edgeR.

Herausforderungen umfassen Mehrdeutigkeiten bei der Read-Zuordnung, Unterschiede in Spleißvarianten, GC-Gehalt und Bias durch Probenqualität. Anwendungen reichen von vergleichenden Expressionsstudien zwischen Bedingungen bis zur Identifikation von Biomarkern und der Konstruktion von Genregulationsnetzwerken.

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