Sequenzierverfahren

Sequenzierverfahren sind Methoden zur Bestimmung der Abfolge von Nukleotiden in DNA oder RNA. Sie ermöglichen die Rekonstruktion von Genomen, Transkriptomen und anderen Sequenzfragmenten und unterscheiden sich in Durchsatz, Leselänge und Genauigkeit.

Die klassische Sanger-Sequenzierung (Dideoxynukleotid-Termination) nutzt ddNTPs, die die DNA-Synthese terminieren. Die synthetisierten Fragmente werden capillarelektrophoretisch getrennt, und anhand der Farbsignale wird die Sequenz abgelesen. Sie bietet hohe Genauigkeit und längere Reads bis ca. 1.000 Basen, hat jedoch eine begrenzte Durchsatzkapazität und ist pro Basenpaar relativ kostenintensiv.

Seit den 2000er-Jahren ermöglichen Hochdurchsatz-Sequenzierverfahren (Next-Generation Sequencing, NGS) die parallele Abfrage großer Sequenzmengen. Typische Plattformen nutzen Sequencing by Synthesis oder Sequencing by Ligation und liefern Millionen bis Milliarden kurzer Reads, meist 50–300 Basen lang. NGS wird breit eingesetzt für Referenzgenom- und Exom-Sequenzierung, Transkriptom-Analysen sowie Metagenomforschung. Die Kurzreads erfordern computergestützte Assemblierung oder Mapping, um komplette Genome zu rekonstruieren.

Langlesungen, d.h. Langread-Sequenzierung, umfassen Technologien wie PacBio SMRT und Oxford Nanopore. Sie liefern deutlich längere Reads (mehrere Kilobasen bis Megabasen), wodurch sich De Novo-Assemblierung und das Erkennen komplexer Strukturen erleichtern. PacBio bietet hohe Einzel-Read-Längen, Nanopore ermöglicht Echtzeit-Daten und tragbare Messgeräte, jedoch waren anfänglich höhere Fehlerraten üblich; beide verbessern sich durch Konsensusbildung und Fehlerkorrektur.

Die Auswertung umfasst Basenaufruf, Qualitätskontrollen, Ausrichtung gegen Referenzgenome, Varianten- und Transkriptanalysen sowie Assemblierung. Sie erfordert spezialisierte Software und leistungsfähige Rechenressourcen.