SangerSequenzierung

Die SangerSequenzierung ist ein DNA-Sequenzierverfahren, das von Frederick Sanger entwickelt und 1977 erstmals beschrieben wurde. Es basiert auf der Kettenabbruchmethode durch den Einsatz von dideoxynukleotiden (ddNTPs), die die DNA-Synthese terminieren und so Fragmentlängen bestimmen.

Prinzip: Eine Vorlage-DNA wird mit einem Primer, einer DNA-Polymerase, normalen dNTPs und einer geringen Menge ddNTPs repliziert. Wird ein ddNTP in den wachsenden Strang eingebaut, endet die Verkettung an dieser Stelle. Für jede Base (A, C, G, T) entstehen terminierte Fragmente unterschiedlicher Länge. In modernen Ansätzen werden die vier ddNTPs meist fluoreszenzmarkiert und in einer oder mehreren Reaktionen kombiniert. Die Fragmentmengen werden durch Gelelektrophorese oder Capillar-Elektrophorese getrennt und der Detektor liest das Endnukleotid jeder Fragmentlänge, wodurch die Sequenz rekonstruiert wird.

Historische Entwicklung: Die Methode wurde in den 1980er Jahren automatisiert, wodurch farbmarkierte ddNTPs und Kapillarelektrophorese die Durchsatzleistung erhöhten. Kommerzielle Systeme ab Mitte der 1990er Jahre ermöglichten schnelle Sequenzierung kleiner bis mittlerer DNA-Abschnitte. Die Sanger-Sequenzierung erreichte typischerweise Leselängen von rund 600 bis 1.000 Basenpaaren.

Anwendung und Bedeutung: Sie wird heute vor allem für die Verifikation von Klonprodukten, die Sequenzierung einzelner Gene, Finishing von Genomen und problematische Regionen genutzt, bei denen hohe Genauigkeit wichtig ist. Für groß angelegte Genomprojekte hat Next-Generation-Sequencing den Großteil übernommen; Sanger bleibt jedoch ein zuverlässiges Werkzeug für Kleinprojekte und Quality-Control-Aufgaben.