RNAsekvensointi

RNAsekvensointi on korkeatehoinen molekyylibiologian menetelmä, jolla mitataan koko transcriptomin ilmentymää sekvensoimalla cDNA:ta, joka on valmistettu solun RNA:sta. Menetelmä tuottaa kvantitatiivista tietoa geenien ilmentymistasoista sekä mahdollistaa uusien transkriptioiden ja vaihtoehtoisten isoformien havaitsemisen.

Työprosessi koostuu näytteiden keruusta, RNA:n eristämisestä ja laadunvarmistuksesta, kirjaston valmistuksesta (fragmentointi, cDNA-synteesi, adapterien lisääminen) sekä sekvensoinnista. Bulk RNA-seq mittaa ilmentymää useammasta solusta kerrallaan, kun taas single-cell RNA-seq (scRNA-seq) mahdollistaa ilmentymän tarkastelun yksittäisten solujen tasolla.

Teknologisesti käytetään pääasiassa Illumina-alustoja, jotka tuottavat suuria määriä lyhyitä lukupätkiä. Pitkän luennan teknologiat, kuten PacBio Iso-Seq ja Oxford Nanopore, mahdollistavat kokonaistranskriptien lukemisen ja isoformien pitkäaikaisen havaitsemisen. Yksittäissoluisiin liittyvissä kokeissa on käytössä droplet-pohjaisia menetelmiä (esim. 10x Genomics) sekä Smart-seq.

Bioinformatiikassa data käy läpi laadunvalvonnan, trimmaamisen sekä kohdistamisen referenssi-genomiin tai -transkriptomeen (esim. STAR, HISAT2). Kvantifiointi tapahtuu ohjelmilla kuten featureCounts, Salmon tai Kallisto, ja normalisointi sekä differentiaalinen ilmentymäanalyysi toteutetaan esimerkiksi DESeq2 tai edgeR. Tutkimukset voivat sisältää vaihtoehtoisten splicing-tapahtumien analyysin, isoformien erottelun sekä uuden transkriptin löytymisen.

RNA-seqillä voidaan kartoittaa geenien ilmentymää eri olosuhteissa, tutkia splicingia sekä non-coding RNA:ita, ja tukea tutkimusta muun muassa syöpä-, kehitys- ja mikrobiologian aloilla. Haasteina ovat RNA:n laatu, rRNA-poisto, kirjaston vinoumat, kustannukset sekä monimutkainen datan tulkinta. Tulokset tallennetaan ja jaetaan yleisesti käytetyillä tiedostomuodoilla (FASTQ, BAM, GTF).