PCRmenettelyä

PCR-menettelyä (polimeraasiketjureaktio) on molekyylibiologiassa laajasti käytetty tekniikka, jonka avulla DNA:n haluttu alue voidaan monistaa nopeasti pienestä määrästä alkuperäistä materiaalia. Menetelmän tavoitteena on tuottaa suuria määriä identtistä tuotetta, jota voidaan käyttää analyyseihin, sekvensointiin tai diagnostiikkaan. Periaate perustuu toistuvaan lämpötilakiertoon, jossa DNA-juosteet denaturoituvat, primerit sitoutuvat kohdejaksoihin ja DNA-polymeraasi rakentaa uusia kopioita. Kierrosten toistuminen johtaa halutun tuotteen eksponentiaaliseen kasvuun.

Reaktiota varten tarvitaan DNA-matriisi, kaksi primeriparia, DNA-polymeraasia, dNTP-yhdisteet sekä reaktioliuos ja sopivat kofaktorit, kuten Mg2+. Primereiden suunnittelu ja reitin valinta määrittelevät, mikä alue monistuu. Reaktiota ohjataan käyttötilanteen mukaan erilaisilla lämpötilan ja ajan asetuksilla, mutta yksityiskohtaiset protokollat ovat laboratorio-olosuhteiden hallinnassa.

PCR:n käyttötarkoitukset ovat laajat. RT-PCR yhdistää käänteisen transkription RNA:sta DNA:ksi ennen klassista PCR:ää. Real-time PCR eli qPCR mittaa tuotteen syntyä reaaliajassa fluoresenssilla, mikä mahdollistaa nopean kvantitatiivisen analyysin. Digitaalinen PCR (dPCR) taas jaottelee näytteet yksittäisiksi kopioiksi ja mahdollistaa tarkan määrän arvioinnin. Näitä menetelmiä hyödynnetään patogeenien tunnistuksessa, geneettisessä diagnostiikassa sekä tutkimuksessa ja prekliinisessä kehityksessä.

Kontrollit: negatiivinen kontrolli (ei DNA:tä sisältävä aine), positiivinen kontrolli ja usein sisäiset kontrollit. Turvallisuus ja käytännön rajoitukset: PCR on erittäin herkkä kontaminaatiolle; tilat ja käytännön menettelyt sekä tiedonhallinta on suojattava. Lisäksi olosuhteisiin reagointiteho ja primerien valinta voivat rajoittaa tulosten luotettavuutta.