Krioelektronmikroskopi

Krioelektronmikroskopi adalah teknik untuk mempelajari struktur biomolekul pada resolusi molekuler dengan menggunakan mikroskop elektron yang operasikan pada suhu sangat rendah. Sampel diekstraksi dalam keadaan beku secara cepat menjadi vitreous ice, sehingga struktur biologis tetap terjaga tanpa pewarnaan kimia.

Prinsip utama krioelektronmikroskopi adalah imaging sampel beku tanpa kontras pewarnaan, dengan berkas elektron berenergi tinggi yang diarahkan melalui sampel tipis di dalam sebuah TEM. Kontras diperoleh melalui defokus dan intepretasi sinyal difraksi, sementara gambar direkam sebagai seri frame untuk memungkinkan koreksi gerakan akibat paparan radiasi. Dua pendekatan utama adalah single-particle analysis (SPA), yang membangun struktur 3D dari banyak partikel individual, dan cryo-electron tomography (cryo-ET), yang menghasilkan gambar 3D dari objek berukuran lebih besar melalui pemindaian proses.

Persiapan sampel melibatkan persiapan grid logam atau karbon yang sangat tipis, disiapkan dengan glow discharge untuk meningkatkan hidrofilisitas, diisi dengan sampel, lalu dibekukan dengan plunge freezing ke dalam etana cair yang sangat dingin. Alur kerja umum meliputi pengambilan data di TEM dengan dosis elektron rendah, koreksi gerakan bingkai, estimasi CTF, pemilihan partikel, klasifikasi 2D, rekonstruksi 3D, dan penyempurnaan model untuk mencapai resolusi yang diinginkan.

Krioelektronmikroskopi menawarkan kelebihan seperti tidak memerlukan kristalisasi, kemampuan memeriksa kompleks protein besar dan fleksibel, serta potensi mencapai resolusi mendekati atom. Keterbatasannya meliputi kebutuhan peralatan mahal, fasilitas penyimpanan data besar, serta tantangan pada sampel yang heterogen atau orientasi partikel yang tidak merata. Sejarahnya terkait dengan pengembangan teknik optimasi sejak 2000-an, dan perolehan Nobel pada 2017 oleh Dubochet, Frank, dan Henderson menandai kemajuan signifikan di bidang ini.