viitegeeniä

Viitegeeni on endogeeninen geeni, jota käytetään normaalointikontrollina geenilukujen ilmentymässä, erityisesti RT-qPCR-tutkimuksissa. Sen tarkoituksena on tasoittaa näytteiden välistä vaihtelua RNA:n määrästä, laadusta ja käänteiskäännöksen tehokkuudesta. Kohdegeenien ilmentymä esitetään suhteessa viitegeenien ilmentymään, tavallisesti delta Ct -arvojen tai delta-delta Ct -arvojen avulla, jolloin saadaan relative-lukuarvoja tai fold-change -tuloksia.

Viitegeenin valintaan vaikuttavat kaksi päävaatimusta: sen ilmentymän vakaus kaikissa koeolosuhteissa ja näytteissä sekä sen ilmentymätason samankaltaisuus kohdegeenien ilmentymän kanssa. Yleisesti suositellaan käyttämään useampaa kuin yhtä viitegeeniä ja testaamaan niiden vakaus ennen lopullista normaalointia. Yleisimmät ehdokkaat ovat housekeeping-geenejä kuten GAPDH, ACTB, 18S rRNA sekä muita ribosomaalisia geenejä kuten RPLP0 tai HPRT1. On kuitenkin tärkeää huomata, että viitegeenin vakaus vaihtelee kontekstin mukaan, joten yksittäinen geeni ei sovi kaikkiin tilanteisiin.

Normaalointia voidaan toteuttaa käyttämällä viitegeenien geometrista keskiarvoa tai useampia geenejä. Vakauden arviointiin on käytössä ohjelmia kuten geNorm, NormFinder ja BestKeeper. Kun viitegeenit on valittu, kohdegeenin ilmentymä normalisoidaan delta Ct -menetelmällä ja mahdollisesti fold-change -analyyseillä. On tärkeää muistaa, että viitegeenin muutos voi vinouttaa tuloksia, joten viitegeenin valinta on tehtävä huolellisesti. Lisäksi RNA-seq -analyysissä käytetään muita normalisointimenetelmiä, eikä viitegeeniä tulisi pitää ainoana normaalointilähteenä.