spektrofotometrisesti

Spektrofotometria on analyyttinen menetelmä, jolla tutkittavan näytteen valon absorptio tai transmittanssi mitataan eri aallonpituuksilla. Menetelmää käytetään pääasiassa kvantitatiiviseen analyysiin: yhdisteen konsentraation määrittämiseen sekä reaktioiden seuraamiseen ja kinetiikan tutkimiseen.

Spektrofotometrissä käytetään valonlähdettä, näytekaulusta (cuvette), sekä laitetta aallonpituuden valitsemiseksi joko monokromatorin tai suodattimen avulla. Detektori mittaa läpikulkevan valon intensiteetin. Näytteet mitataan sekä näytteen että nollatason (blankin) kanssa, ja polttopituus on tyypillisesti noin 1 cm. Käytännössä mittauksia voidaan tehdä absorbanssina tai transmittanssina.

Perusperiaate perustuu Beer-Lambertin lakiin: A = εlc, jossa A on absorbanssi, ε molaalinen absorptiivisuus, l poltto- eli optisen polun pituus ja c konsentraatio. Absorptio voidaan muuntaa transmittanssiksi T = I/I0 ja absorbanssi A = -log10(T). Näin syntyy kalibraatiokäyrä, jonka avulla tuntemattoman näytteen konsentraatio voidaan määrittää.

Sovellukset kattavat monia aloja: kvantitatiivinen analyysi kuten yhdisteiden pitoisuuksien mittaus, DNA/RNA ja proteiinien kvantitatiivinen arviointi (esim. A260/A280), sekä reaktioiden kinetiikan seuranta. Käytännön käyttökohteita ovat biologia, lääke- ja ympäristöanalytiikka sekä elintarviketeollisuus.

Rajoitteisiin kuuluvat useiden yhdisteiden samankaltaiset absorptiot, näytteen turvotus tai sameus, sekä kalibrointi- ja käytön herkkyyteen liittyvät vivahteet. Luotettavat tulokset edellyttävät huolellista blanks- ja standardien hallintaa sekä asianmukaista näytteenvalmistusta.