krysskoblingsmassespektrometri

Krysskoblingsmassespektrometri (krysskoblings-MS eller XL-MS) er en metode innen proteomikk og strukturell biologi som bruker kjemiske krysskoblere for å binde to aminosyre-rester i eller mellom proteiner. Etter fordøyelse identifiseres krysskoblete peptider av massespektrometri og brukes til å generere avstandsrestriksjoner og kartlegge proteinkomplekser og interaksjoner i forhold som gjenspeiler nær naturlige forhold.

Prinsipp: Krysskobleren er bifunksjonal og reagerer med spesifikke sidekjeder (for eksempel primære aminer eller carboxylgrupper). Den danner en kovalent kobling mellom to posisjoner innenfor en forventet avstand, som avhenger av krysskoblerens lengde. Etter fordøyelse blir krysskoblete peptider analysert i MS/MS for å identifisere par av peptider og dermed koblingen mellom proteiner eller regioner.

Arbeidsflyt: Krysskoblingen gjennomføres i prøven, reaksjonen stoppes, prøven fordøyes proteolytisk (oftest med trypsin), og krysskoblete peptider blir ofte beriket før massespektrometri. Isotopisk merking brukes ofte for å lette identifikasjon og kvantifisering. Dataanalysen skjer med programvare spesialisert for XL-MS (for eksempel pLink, XlinkX, StavroX, Xi, Kojak). Resultatene gir avstandsrestriksjoner som inngår i modellering.

Bruksområder: XL-MS brukes til å kartlegge protein–protein-interaksjoner, studere store proteinkomplekser og i integrativ modellering sammen med cryo-EM, X-ray eller NMR. Det kan også anvendes i celler eller andre komplekse miljøer ved in vivo krysskobling under kontrollerte forhold.

Fordeler og utfordringer: Metoden gir avstandsrestriksjoner i fysiologiske forhold og kan avsløre dynamikk, men krever avansert massespektrometri og komplisert dataanalyse, og det er risiko for falske positiver og lav forekomst av krysskoblete peptider.