ampliconsekvensointi

Ampliconsekvensointi on kohdennetun DNA-sekvensoinnin muoto, jossa tiettyjä geneettisiä alueita monistetaan PCR:llä ja näitä ampliceja sekvensoidaan. Menetelmä mahdollistaa suurta syvyyden eli monien lukujen saamisen yhdestä näytteestä, jolloin voidaan havaita harvinaisempiakin variantteja ja tarkastella alueen monimuotoisuutta. Sitä käytetään yleisesti mikrobiomitutkimuksessa, jossa kohde voi olla esimerkiksi 16S rRNA -geeni tai ITS-alue, sekä muissa kohdennetuissa genomianalyyseissä kuten mutaatioiden seulonnassa tai geneettisissä paneeleissa.

Prosessi etenee yleensä seuraavasti: suunnitellaan kohdealueen ympärille sopivat primerit, suoritetaan PCR-amplicatio, valmistellaan sekvensointikirjasto lisäämällä adapterit ja indeksit, ja suoritetaan sekvensointi valitulla alustan tekniikalla (esim. Illumina, PacBio, Oxford Nanopore). Saatu data käsitellään laadunvalinnalla, demultiplexingillä ja mahdollisesti yhdistämällä paired-end -lukemat; tämän jälkeen suoritetaan virheenkorjaus ja ryhmittely kohti ASV- tai OTU-ryhmiä sekä lajintunnistus viitekantaan.

Sovellukset kattavat mikrobiomianalyysin, patogeenien havaitsemisen, kohdennetut geenialueet koskevat mutaatioiden seurantatehtävät sekä kliiniset ja tutkimukseen liittyvät paneelit. Edut ovat korkea syvyys, kustannustehokkuus pienille kohdealueille ja nopea skaalautuvuus. Rajoituksia ovat PCR- ja primerivaihtelut, mahdolliset chimera-ilmiöt sekä tieto vain valitusta alueesta, mikä rajoittaa kokonaisgenettisen monimuotoisuuden kartoitusta.