Tvåfotonsmikroskopi

Tvåfotonsmikroskopi är en fluorescensmikroskopiteknik där fluoroforer exciteras av två fotoner som absorberas samtidigt. Oftast används pulserande nära infrarött ljus, och excitationen sker främst i fokus eftersom tvåfotonabsorptionen är en icke-linjär process.

Excitationens sannolikhet är proportional med kvadraten av ljusstyrkan, vilket kräver mycket hög intensitet. Detta uppnås med pulserande ultrakorta lasrar (ofta femtosekund). Den icke-linjära karaktären gör att excitationen är lokaliserad till fokalzonen och ger därmed inbyggd optisk sektionering.

Uppsamlingen sker med högNA-objektiv och en scanner som galvanometer eller resonansscanning. Fluorescens från fokus samlas in av känsliga detektorer som PMT eller SPAD och registreras som tvådimensionella bilder eller tre-dimensionella stackar. Tekniken minskar bakgrundsfluorescens utanför fokus och möjliggör volymbaserad avbildning i tjocka vävnader.

Fördelar inkluderar bättre djupbildning i vävnad med låg fototoxicitet och minimal fotoblekning utanför fokalt område jämfört med konventionell fluorescencemikroskopi. NIR-ljus gör att vävnad penetreras bättre och möjliggör levande provbildning. Begränsningar är hög kostnad och teknisk komplexitet, krav på kraftfulla ultrafast-lasrar samt ofta starkare signalbehov för vissa fluoroforer.

Användningsområden inkluderar neurovetenskaplig in vivo-hjärnbildning, utvecklingsbiologi, kalciumimaging i tjocka vävnader och tredimensionell visualisering av cellpopulationer. Historiskt utvecklades metoden i början av 1990-talet av Denk, Strickler och Webb och har sedan blivit ett vanligt verktyg inom biologi och medicin.