Spektrofotometrit

Spektrofotometrin är en analytisk metod som mäter hur mycket ljus ett prov absorberar vid en specifik våglängd. Genom att jämföra ljusmängden som når detektorn med och utan provet kan man bestämma absorbansen och därmed provets koncentration, ofta med hjälp av Beers lag.

Instrumentet består av en ljuskälla, en våglängdsselektor (monokromator eller filter), en provkammare med cuvetter och en detektor (till exempel fotodiod eller fotomultiplikator). Signalen omvandlas till absorbans eller transmittans och presenteras i ett digitalt eller grafiskt format. Mätningar sker vanligtvis i UV-Vis-området, cirka 190–1100 nm, men även längre våglängder kan användas beroende på ämnet.

Principen bygger på att absorbansen A är proportionell mot koncentrationen c och ljusets genomträngningslängd l enligt Beers lag: A = ε l c, där ε är molär absorptivitet. Transmittans är T = I/I0 och absorbansen A = -log10(T). För kvantifiering används kalibreringskurvor upprättade med standardlösningar över ett definierat koncentrationsintervall.

Typiska tillämpningar omfattar kvantifiering av färgämnen, läkemedel och kemikalier, analys av nukleinsyror och proteiner i biokemi, samt miljö- och livsmedelsanalys. Spektrofotometri används också för att övervaka reaktionskinetik och för kvalitetskontroll i industriella processer.

Begränsningar innefattar avvikelse från Beers lag vid höga koncentrationer, störningar från andra absorberande ämnen, behov av noggrant kalibrerade cuvetter och våglängdsstabilitet samt påverkan av bakgrundsbaslinjer och optisk strålning.