kryoelektronimikroskopia

Kryoelektronimikroskopia (cryo-EM), biyolojik makromoleküllerin yakın-nativ durumunu koruyarak yüksek çözünürlükte üç boyutlu yapılarını belirlemeyi amaçlayan bir elektron mikroskobu yöntemidir. Numuneler kriyojenik koşullarda, hızlı vitrifikasyonla amorf buz içinde dondurulur ve kristalleşme gerekmeden görüntülenir. Bu sayede büyük kompleksler ve dinamik bölgeler için de yapılar elde edilebilir.

Numune hazırlığında çözelti, ince film halinde karbon destekli ızgara üzerine alınır. Numune, sıvı etan ile hızlı bir şekilde soğutularak vitrifikasyon sağlanır ve sıvı nitrojene daldırılarak depolanır. Bu süreç suyu amorf buz içinde dondurur ve kristalleşmeyi engeller; böylece numunenin çözelti içindeki yapısı daha doğal bir ortamda korunur.

İmgelemede elektron ışını kullanılır ve radyasyon hasarını azaltmak amacıyla düşük dozlar uygulanır. Modern cryo-EM kurulumlarında direct electron detectorleri ve enerji filtreleri öne çıkar. Ana modlar arasında tek parçalı cryo-EM (single-particle) ile izole moleküllerin 3D yapısının belirlenmesi ve cryo-elektron tomografisi (cryo-ET) ile hücre içi bağlamın 3D görüntüsünün elde edilmesi bulunur.

Veri işleme aşamasında binlerce görüntü birleştirilir; 2D sınıflandırma, 3D rekonstrüksiyon ve güvenilirlik için “gold standard” FSC 0.143 kriteri kullanılır. Sonuç olarak 3D yoğunluk haritaları elde edilir ve gerekirse atomik modeller bu haritalara oturtulur veya de novo yapılandırma yapılır. Cryo-EM, yapı biyolojisi, viroloji ve membran proteinleri gibi alanlarda önemli bir araç olarak kabul edilir; buna karşın numune homojenliği, görüntüleme zorlukları ve yüksek hesaplama gereksinimleri gibi sınırlamalara tabidir.