Spektrifotometrillä

Spektrifotometrillä tarkoitetaan välineistöä, jolla voidaan mitata näytteiden valo-absorptio tai transmittanssi eri aallonpituuksilla. Yleensä käytetään kvantitatiivisiin analyyseihin, joissa absorbanssi korreloi aineen pitoisuuteen Beer-Lambertin lain kautta.

Perusperiaate: lampusta lähtevä valo kulkee kautta näytteen kuvetin ja valitun aallonpituuden läpi monokromaattorin tai spektroskooppisen suodattimen avulla. Vastaanotettujen fotonien määrä mitataan detektorilla (esim. fotodiodi tai PMT). Tulokset esitetään absorbanssina A tai transmittanssina T, ja relation A = -log10(T) sekä A = εlc.

Komponentit ja käyttö: järjestelmä koostuu valonlähteestä (deuterium-lamppu, halogeenilamppu, LED), monokromaatista säätimestä (prisma tai grating), näytekupista, detektorista sekä tietokone- tai näytönohjausjärjestelmästä. Järjestelmät voivat olla yksipiirisiä (single-beam) tai kaksipiirisiä (double-beam), ja ne voivat toimia sekä skannaus- että kiinteän aallonpituuden mittauksin.

Sovellukset: spektrifotometrejä käytetään pitoisuuksien määrittämiseen, entsyymi-, pigmentti- ja nucleiin hajoitus- sekä proteiinimäärityksissä (esim. A260, A280), DNA-/RNA-analyyseissä sekä vesinäytteiden ja ympäristöanalyysien laadunvalvonnassa. Klinisissä laboratorioissa ne tukevat monia biokemiallisia ja diagnostisia mittauksia.

Kalibrointi ja virhelähteet: mittaukset edellyttävät kalibrointia standardeilla sekä näiden taustan korrigointia blankoilla. Virheitä voivat aiheuttaa sameus, värillisyys, epäpuhtaudet sekä epäyhtenäiset kupeissa tai poltto- ja valonlähteen vaihtelu.

Edut ja rajoitukset: spektrifotometreilla on nopea sekä pieninä määrinä käytettävä analyysi, mutta ne ovat herkkiä näytteiden värillisyydelle ja sameudelle, mikä vaatii korjauksia. UV-Vis-alueen yleinen mittausala on noin 190–1100 nm, riippuen laitteesta.