Sequenzieren

Sequenzieren bezeichnet das Bestimmen der Abfolge von Nukleotiden in DNA oder RNA. Ziel ist es, die genetische Information eines Organismus, Gewebes oder einzelner Moleküle sichtbar zu machen. Die klassische Methode ist die Sanger-Sequenzierung, eingeführt in den 1970er-Jahren, bei der Kettenabbruchreaktionen mit Capillar electrophorese kombiniert werden. Sie liefert sehr genaue Sequenzen, eignet sich jedoch für relativ kurze Fragmente und ist bei größeren Genomen kosten- und zeitintensiv.

In den letzten Jahrzehnten entstanden Hochdurchsatz- bzw. Next-Generation-Sequencing-(NGS)-Technologien, die viele Fragmente parallel lesen. Systeme wie Illumina erzeugen kurze Reads von typischerweise 100–300 Basen. Lange Reads werden durch Third-Generation-Technologien bereitgestellt, etwa PacBio SMRT und Oxford Nanopore, die Moleküle längerer Abschnitte lesen können. Langreads erleichtern De-novo-Assemblies und das Verständnis komplexer Genome, weisen aber oft höhere Fehlerraten auf, die durch Re-Sequenzierung oder Fehlerkorrektur gemildert werden.

Ablauf: Probenaufbereitung, Bibliotheksherstellung, Sequenzierung und anschließende Bioinformatik. Ausgelesene Reads werden auf Qualität geprüft, an Referenzgenome ausgerichtet oder zu neuen Genome-Sequenzen zusammengefügt. Wichtige Größen sind Abdeckung (Coverage) und Read-Länge. Ergebnisse können als Varianten (SNPs, Indels), Genom- oder Transkriptom-Profile berichtet werden.

Anwendungen umfassen Grundlagenforschung, menschliche und mikrobiologische Genomik, Krebsgenomik, metagenomische Analysen, personalisierte Medizin und forensische Sequenzierungen. Zu den Herausforderungen zählen hohe Datenmengen, Kosten, notwendige Bioinformatik-Kompetenz sowie technische Biases und Fehlerraten in bestimmten Sequenzierungsmethoden.