Sekvensointimenetelmät

Sekvensointimenetelmät ovat menetelmiä, joilla DNA:n tai RNA:n emäsjärjestys määritetään. Nykyään käytetään sekä perinteisiä sekvensointitekniikoita että korkean läpimenon (NGS) menetelmiä. Eri menetelmillä on erilaisia tarkkuuksia, lukupituuksia ja sovelluksia.

Sanger-sekvensointi, eli ketjureaktiossa toimiva dideoksinukleotidien menetelmä, tuottaa korkean tarkkuuden tuloksia pienissä mittakaavoissa. Fragmentit erotellaan kapillaarielektroforeesissa, ja lukupituudet ovat tyypillisesti noin 800–1000 emästä. Sitä käytetään yleisesti tarkistuksiin ja pienimuotoisiin sekvensointipyyntöihin.

NGS-menetelmät mahdollistavat samanaikaisen sekvensoinnin miljoonilla fragmenttilohkoilla. Tärkeimpiä alalajeja ovat Illumina (sekuensointi synteesillä), Ion Torrent (puolijohdepiiriin perustuva sekvensointi), sekä pitkän luokan tekniikat kuten PacBio SMRT ja Oxford Nanopore. Lyhyet lukusarjat ovat erittäin tarkkoja ja soveltuvat suurten genomien nopeaan kartoitukseen, kun taas pitkät lukusarjat helpottavat de novo -koostamista ja rakenteellisten varianttien tunnistamista. Kirjastonvalmistuksessa fragmentointi ja adapterien kiinnitys ovat yleisiä vaiheita; joskus käytetään PCR-vaihetta, toisinaan ei.

Sovellukset kattavat koko genomin sekvensoinnin (WGS), exomisekvensoinnin (WES), kohdennetun sekvensoinnin, RNA- sekvensoinnin (RNA-Seq), metagenomisen tutkimuksen sekä epigenetiikan tutkimuksen, jossa erityisesti Nanopore-tekniikat voivat tarjota suoran metylaation havaitsemisen.

Tietojen analyysi alkaa basecallauksesta ja laadunvalvonnasta, edeten kenttään kuten aligningiin, koosteisiin ja varianttien havaitsemiseen. Käytössä on monipuolisia bioinformatiikkatyökaluja ja tiedostomuotoja kuten FASTQ, BAM ja VCF. Tietoturva ja eettiset näkökulmat ovat olennaisia kliinisissä ja tutkimuksellisissa asetuksissa.