Sangersekvensointi

Sangersekvensointi on DNA:n sekvensointimenetelmä, joka kehitettiin 1970-luvulla Frederick Sangerin ja hänen kollegoidensa toimesta. Menetelmän perusta on ketjunsäätöperiaatteessa: DNA-polymeraasin avulla templaatin DNA:tä kopioidaan normaalien dNTP- eli deoksynukleotidien ohella dideoksynukleotideilla (ddNTP), joilla puuttuu 3'-hydroksyyliryhmä, mikä pysäyttää uuden DNA-säikeen kasvun. Eri ddNTP:t lopettavat ketjut satunnaisiin kohtiin, jolloin syntyy fragmentteja, joiden pituus vastaa seuraavan lisäyksen paikkaa templaatissa. Alkuvaiheessa käytettiin neljää erillistä reaktiota, joissa kukin ddNTP lopetti ketjun tietyllä emäksellä; tuotteet erotettiin geelillä. Myöhemmin otettiin käyttöön automaattinen, fluoresenssijohteinen versio, jossa kaikille neljälle ddNTP:lle on oma fluorofori, ja fragmenttien pituudet erotellaan kapillaarielektroforeesissa ja sekvenssi luetaan automaattisesti.

Sangersekvensointi oli pitkään vallitseva DNA-sekvensointitekniikka ja sitä käytettiin muun muassa plasmiden, PCR-tuotteiden sekä lyhyiden genomien sekvensointiin. Se tarjoaa korkean tarkkuuden, mutta sen läpivirta on rajallinen ja kustannukset suuremmat suurissa määrissä verrattuna nykyaikaisiin seuraavan sukupolven sekvensointitekniikoihin (NGS). Nykykäytössä Sanger-sekvensointi soveltuu edelleen pienempiin projekteihin, laadunvarmistukseen sekä tilanteisiin, joissa tarvitaan yksittäisiä pitkiä luettavia alueita.