Primeeditointia

Primeeditointi on geeninmuokkausmenetelmä, joka mahdollistaa tarkat pienet muutokset ilman kaksoisjuostetta tai tarvetta donor-DNA:lle. Menetelmässä käytetään Cas9-nickaasia, joka on yhdistetty käänteiskopioijaentsyymiin (RT), sekä erityistä pegRNAa (prime editing guide RNA), joka ohjaa kohteen lisäksi sisältää mallin halutulle muutokselle.

Mekanisimi: Cas9-nickaasin mukaan ohjattu nyhkäisy tekee pienen katkoksensa DNA:n yksijuosteiseen kohtaan. RT käyttää pegRNA:n käänteiskopioijamallia kirjoittaakseen halutun muutoksen kohdealueelle, jolloin syntyy muokattu DNA-säie. Tämä lähestymistapa voi johtaa lopulliseen muokkaukseen toleraattisesti ilman tarvetta suurelle kaksoisjuosteelle. Joissakin versioissa otetaan käyttöön lisäksi toinen nikkeli vastakkaiselle DNA-säikeelle (ns. PE3-tyyppinen lähestymistapa), mikä voi lisätä muokkaustehoa.

Minkälaisiin muutoksiin se soveltuu: Primeeditointi mahdollistaa pienten korvaavien muutosten, pienten lisäysten ja pienten poiston tekemisen. Suuremmat muutokset ja suuret insertiot/potentiaalisesti suuret korvaukset eivät ole sen vahvuus. Se ei vaadi donor-DNA:ta ja voi pienentää ei-toivottujen muokkauksien riskiä verrattuna perinteisiin korvausmenetelmiin, mutta muokkauksen tehokkuus vaihtelee solutyypin ja kohteen mukaan sekä vaatii oikeanlaisen PAM-sijainnin.

Rahoitus ja käytännön sovellukset: Primeeditointia on käytetty koe-eläimissä ja soluissa, ja sen odotetaan olevan hyödyllinen sekä tutkijoiden että mahdollisesti tulevien terapeuttisten sovellusten kannalta. Haasteina ovat suuremman koon Cas9-RT-yhdistelmän toimitus, tarjolla olevien PAM-PAK-lähestymistapojen rajoitukset sekä off-target -vaikutusten hallinta. Kehitys etenee uusilla variantteilla ja parannuksilla, jotka voivat laajentaa sekä tehokkuutta että PAM-rajat.

Historia: Menetelmää esiteltiin 2019 Nature-tiedelehdessä Anzalone ja kolleegoiden toimesta. Primeeditointi tarjoaa vaihtoehdon perinteisille CRISPR-Cas9 -menetelmille sekä base-editoinnille, erityisesti tilanteissa, joissa tarvitaan tarkkaa pienehköä muutosta ilman kaksijuosteista katkoa.