PCRtehnika

PCR-tehnika ehk polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) on molekulaargeneetikas ja diagnostikas laialdaselt kasutatav meetod DNA koopia suurendamiseks. Meetod võimaldab kiiresti ja spetsiifiliselt paljundada valitud DNA lõiku paljude korduste jooksul.

Peamised komponendid on DNA mall, kaks lühikest DNA primerit, termostabilne DNA polümeraas (tavaliselt Taq), nukleotiidid (dNTP-d), sobiv buffer ja Mg2+-ioonid, mis on polümeraasi aktiivsuse jaoks vajalikud.

Protsess koosneb korduvatest temperatuuritsüklitest: denaturatsioon umbes 94–98°C, annealing ehk primerite kinnitumine umbes 50–65°C, pikendamine umbes 72°C. Iga tsükkel suurendab paljundatavate lõikude arvu; tavaliselt tehakse 25–40 tsüklit. Lõplikult on paljundatud DNA kogus märkimisväärselt suurenenud.

Variandid: RT-PCR ühendab reverse transcriptioni RNA-st cDNA-ks ja seejärel PCR; qPCR ehk kvantitatiivne või real-time PCR mõõdab paljundamist tsükli ajal fluorestentsed märgised abil; digital PCR ja multiplex-PCR võimaldavad samaaegselt analüüsida mitmesid piirkondi või kvantitatiivsust.

Rakendused hõlmavad meditsiinilist diagnostikat (patogeenide ja geneetiliste haiguste tuvastamine), biotehnoloogiat ja kloonimist, forensikat ning kvaliteedikontrolli laborites ning DNA sekveneerimise ettevalmistust.

Piirangud hõlmavad vajadust teada konkreetsete primääride järjestusi, kontaminatsiooniriski ja võimalust valede positiivsete või negatiivsete tulemuste tekkeks, primeride dimereid ja muid tehnilisi kitsaskohti.