PCRSchritten

PCRSchritten bezeichnet die aufeinanderfolgenden Phasen des Polymerase-Ketten-Reaktions-Verfahrens (PCR), das zur gezielten Vervielfältigung einer DNA-Sequenz genutzt wird. Dabei kommen eine hitzestabile DNA-Polymerase, kurze DNA-Primer, Nukleotide sowie Reaktionspuffer zum Einsatz. Das Verfahren lässt sich in einfache Abläufe zerlegen, die in einem Thermocycler in aufeinanderfolgenden Zyklen wiederholt werden, um aus wenigen DNA-Molekülen große Mengen der Zielsequenz zu erzeugen.

Der grundlegende Ablauf umfasst Initialdenaturierung, Denaturierung, Primerannealing und Elongation. In der Regel beginnt man mit einer Initialdenaturierung bei ca. 95 °C, um die Doppelhelix zu trennen. Danach folgen wiederholte Zyklen: Denaturierung bei 94-95 °C (20-30 s), Primerannealing bei 50-65 °C (20-60 s) je nach Primeren, und Elongation bei 68-72 °C (ca. 30-60 s pro Kilobase). Typischerweise werden 25-35 Zyklen durchgeführt, um eine ausreichende Produktmenge zu erzielen. Ein abschließender Final-Extension-Schritt bei 72 °C ist üblich, gefolgt von einer Kühlung.

Varianten umfassen Real-Time-PCR (qPCR) zur Quantifizierung, die während der Amplifikation gemessen wird, sowie Reverse-Transkriptase-PCR (RT-PCR) für RNA-Templates, bei der zuerst ein cDNA-Fragment synthetisiert wird. Wichtige Prozessqualitäten betreffen Primer-Design, Kontaminationskontrolle und die Auswahl geeigneter Polymerasen, die Fehlerraten und GC-Content berücksichtigen. PCR ist ein fundamentales Werkzeug der modernen Molekularbiologie, mit Anwendungen von Diagnostik bis zur Grundlagenforschung.