Fluoresceinfarging

Fluoresceinfarging er en teknikk innen mikrobiologi, histologi og cellebiologi der prøver merkes med fluoroforer som avgir synlig lys når de utsettes for lys i bestemte bølgelengder. Dette gjør det mulig å lokalisere og visualisere spesifikke strukturer som proteiner, DNA eller andre biomolekyler i celler og vev ved hjelp av et fluorescensmikroskop.

Prinsipp og typer: Fluoroforer kan binde seg direkte til mål (direkte fluorescensmerking) eller indirekte via antistoffer eller andre bindere (indirekte fluorescensmerking). Vanlige fluoroforer inkluderer DAPI (DNA, blå), FITC og Alexa Fluor-dyes (grønt til rødt) og TRITC. Immunfluorescens bruker koblede antistoffer; Fluorescens in situ-hybridisering (FISH) bruker fluorescente DNA-prober for å påvise spesifikke sekvenser.

Prosedyre: Prøver fikses (oftest med paraformaldehyd), permeabiliseres, og inkubert med fluoroforer. Etter inkubasjon vaskes prøven og analyseres med et fluorescens- eller konfokal mikroskop. For å unngå fotobleking bør eksitasjon og bildebehandling begrenses, og riktige filtre velges.

Anvendelser: Fluoresceinfarging brukes i diagnostikk og forskning for å kartlegge proteinlokalisering, celletyper og genetisk materiale. Den er sentral i immunfluorescens, molekylær cellebiologi og i FISH for kromosom- eller genlokalisering.

Begrensninger: Signalene avhenger av antistoffers kvalitet og fluoroforens egenskaper; autofluorescense i vev kan komplisere tolkningen; fluoroforer fotobleaches ved lysing. Multikanals bildediagnostikk krever nøye valg av filtre og kontrollprøver.

Sikkerhet og kvalitet: Fluoroforer kan være giftige eller irriterende; arbeid bør skje i egnet laboratorium med riktig avfallshåndtering og dokumenterte protokoller samt kontrollprøver.