Bibliotekförberedelse

Bibliotekförberedelse är processen att omvandla biologiska prover till sekvenseringsbibliotek, vilket möjliggör analys av DNA eller RNA med hög genomströmning. Målet är att skapa representation av provets genetiska material i fragment som har rätt storlek och att varje fragment får adaptersekvenser och, vid behov, indexer för igenkänning och multiplexning i nästa steg.

Ett typiskt arbetsflöde innehåller flera steg. Först genomförs ofta kvalitetskontroll av provet och nedbrytning eller fragmentering av molekylerna, antingen mekaniskt (t.ex. sonikering) eller enzymatiskt. Därefter utförs ändreparation och ofta A-tailing för att förbereda ändarna för ligering av plattformsspecifika adapters. Adapterligering följs av storleksselektion för att få fragment inom önskat intervall. Slutligen kan libraryt fås genom PCR‑förökning eller vara PCR‑fri beroende på applikationen, varefter kvalitet och koncentration bedöms med instrument som fluorometrisk kvantifiering och fragmentanalys.

Olika typer av bibliotek används beroende på forskningsfrågan: hela genomet (WGS) eller exomförberedelser för DNA-bibliotek, målinriktade eller ampliconbaserade bibliotek, samt RNA‑seq bibliotek där mRNA omvandlas till cDNA. Kända plattformar som Illumina kräver olika adapterstrukturer än långläsningsplattformar som PacBio eller Oxford Nanopore.

Nyckelparametrar vid utvärdering inkluderar total mängd, insertstorlek, fragmentprofil och konkurrerande faktorer som adapterdimerer och dupliceringshastighet. Utmaningar inkluderar lågt provinnehåll, nedbrytning, GC-bias samt risk för kontaminering och indexhopp. God bibliotekförberedelse är avgörande för pålitlig sekvensdata och efterföljande analyser.